簡介：目的鼓脹病是因肝脾受傷，疏泄運化失常，氣血交阻致水濕內(nèi)停，以腹脹大如鼓、皮色蒼黃、脈絡(luò)暴露為主要臨床表現(xiàn)的一種病證。其病因比較復(fù)雜，病情易于反復(fù)，預(yù)后一般較差，屬于中醫(yī)風(fēng)、癆、鼓、膈四大難癥之一?，F(xiàn)代多發(fā)的病毒性肝炎肝硬化肝功能失代償期與鼓脹病的病癥類似。本病發(fā)病率高，病死率高，病情危重，嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療以保肝、利尿?qū)ΠY支持為首選治療方法，取得了一定的療效，但復(fù)發(fā)率高，療效不滿意。中醫(yī)辨證論治在改善鼓脹病臨床癥狀，提高生活質(zhì)量方面具有優(yōu)勢，但是由于辨證分型標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，無法進(jìn)行規(guī)范診療，影響了臨床療效進(jìn)一步提高。眾多的相關(guān)研究及文獻(xiàn)報道證型繁雜不一，證據(jù)性不強(qiáng)，難于重復(fù)驗證與推廣，影響著研究水平。循證醫(yī)學(xué)EVIDENCEBASEDMEDICINE，EBM強(qiáng)調(diào)任何醫(yī)療決策應(yīng)建立在最佳科學(xué)研究證據(jù)基礎(chǔ)上。因此，借助現(xiàn)代循證醫(yī)學(xué)技術(shù)對鼓脹證候進(jìn)行規(guī)范化研究，具有重要的理論意義和實用價值。方法采用文獻(xiàn)整理法對中國醫(yī)院數(shù)字化圖書館（）1995年至2005年的資料，進(jìn)行檢索，檢索詞為“肝硬化腹水”，對證型、癥狀兩個基本元素預(yù)處理，建立數(shù)據(jù)庫，利用SPSS統(tǒng)計分析軟件，對本課題建立的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，結(jié)果CHKD期刊全文數(shù)據(jù)庫共檢索出符合中醫(yī)鼓脹病（病毒性肝炎肝硬化肝功能失代償期）文獻(xiàn)入選標(biāo)準(zhǔn)的中醫(yī)辨證論治的文章1604篇，初步獲得鼓脹病（病毒性肝炎肝硬化肝功能失代償期）中醫(yī)證候規(guī)律，根據(jù)本項研究結(jié)果，我們臨床初步制定本病的中醫(yī)證候辨證規(guī)律，將鼓脹?。ú《拘愿窝赘斡不喂δ苁Т鷥斊冢┍孀C分為脾虛濕阻型、寒濕困脾型、脾腎陽虛型、濕熱蘊(yùn)結(jié)型、肝脾血瘀型和肝腎陰虛型六個證型。同時對華佗醫(yī)院2007年11月至2009年02月收治的308例門診及留觀鼓脹?。ú《拘愿窝赘斡不喂δ苁Т鷥斊冢┗颊?，進(jìn)行了鼓脹病證候標(biāo)準(zhǔn)的驗證試驗。本項研究結(jié)果的符合率達(dá)90％，得到了初步驗證。

簡介：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文改造的人乳頭瘤病毒16型E6/E7融合蛋白的表達(dá)及免疫活性和抗癌作用實驗研究姓名周小山申請學(xué)位級別博士專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師趙清正20040101中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士論文KANLDHLFA．3U瓜MCSMRNAⅣ盯TPBSPCRPAGEHRPCRSDSVLPVINKANAMYEINSULFATELACTATEDEHYDROGENASELYMPHOCYTEFUNCTIONRELATEDANTIGEN3LONGTERMINALREPEATMULTIPLECONINGSITESMESSENGERRIBONUCLEICACIDTHIAZOLYLBLUETETRAZOLIUMBROMIDEPHOSPHATEBUFFEREDSALINEPOLYMERSECHAINREACTIONPOLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESISREVERSETRANSCRIPTIONALPOLYMERASEREACTIONSODIUMDODECYLSULPHATEVINLSLIKEPARTICLEVULVALINTRAEPITHELIALNEOPLASIA硫酸卡那霉素乳酸脫氫酶淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原．3長末端重復(fù)序列多克隆位點信使核糖核酸噻唑蘭磷酸緩沖液多聚酶鏈反應(yīng)聚丙烯酰氨凝膠電泳CHAIN逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)十二烷基磺酸鈉病毒樣顆粒外陰上皮內(nèi)瘤變D

簡介：點擊查看更多鐵代謝與病毒性乙型肝炎脂質(zhì)過氧化損傷的關(guān)系.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的構(gòu)建Β連環(huán)蛋白ΒCATENIN特異的RNAI慢病毒表達(dá)載體，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制ΒCATENIN基因表達(dá)，為研究WNTΒCATENIN信號通路提供技術(shù)工具；并利用構(gòu)建的RNAI慢病毒感染小鼠胰島Β細(xì)胞MIN6，觀察WNTΒCATENIN信號通路對MIN6細(xì)胞增殖的影響。方法設(shè)計合成針對ΒCATENINMRNA不同位點的SHRNA編碼序列，連接克隆到慢病毒載體質(zhì)粒中；并通過構(gòu)建過表達(dá)ΒCATENIN的真核載體，與構(gòu)建的RNAI慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T工具細(xì)胞，利用WESTERNBLOT外源性篩選有效干擾質(zhì)粒；然后與輔助載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝病毒、逐孔稀釋法進(jìn)行病毒滴度測定。RNAI慢病毒感染MIN6細(xì)胞，REALTIMEPCRRTPCR和WESTERNBLOT法內(nèi)源性驗證其對細(xì)胞內(nèi)ΒCATENIN基因的抑制效果。利用有效的RNAI慢病毒抑制MIN6細(xì)胞ΒCATENIN表達(dá)，下調(diào)WNT信號，MTT法檢測經(jīng)典WNTΒCATENIN信號通路對MIN6細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果1、成功構(gòu)建了針對Β連環(huán)蛋白基因不同位點的RNAI慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒，經(jīng)PCR和測序鑒定干擾片斷的堿基序列及插入位點完全正確；成功構(gòu)建了ΒCATENIN基因過表達(dá)真核生物載體質(zhì)粒，與鑒定正確的慢病毒載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，WESTERNBLOT檢測表明構(gòu)建的載體質(zhì)粒能夠有效敲減細(xì)胞內(nèi)ΒCATENIN水平；將重組慢病毒載體質(zhì)粒與輔助包裝載體質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝、擴(kuò)增慢病毒，獲得高滴度慢病毒上清。2、RTPCR和WESTERNBLOT檢測RNAI慢病毒感染MIN6細(xì)胞后，可以高效抑制ΒCATENIN基因的表達(dá)。3、有效的RNAI慢病毒感染MIN6細(xì)胞下調(diào)WNTΒCATENIN信號通路后可以明顯抑制胰島Β細(xì)胞的增殖。結(jié)論構(gòu)建的特異RNAI慢病毒能夠有效抑制ΒCATENIN基因的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)目的基因MRNA和蛋白的水平，可以作為研究WNTΒCATENIN信號通路的重要技術(shù)手段；WNTΒCATENIN信號通路對MIN6細(xì)胞的增殖有重要影響。

簡介：中山大學(xué)碩士學(xué)位論文鼻咽原發(fā)性淋巴瘤的臨床病理特征及EPSTEINBARR病毒感染狀況姓名黃雨華申請學(xué)位級別碩士專業(yè)腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師吳秋良20090521中山大學(xué)碩士學(xué)位論文鼻咽原發(fā)性淋巴瘤的臨床病理特征及EPSTEINBARR病毒感染狀況方法1回顧性分析2001年1月至2008年9月中山大學(xué)腫瘤防治中心病理科診斷的109例連續(xù)的鼻咽原發(fā)性淋巴瘤的臨床資料；2收集所有病例的蠟塊，切片作一系列免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行免疫表型分型；3運用EBV編碼的小RNAEBERS原位雜交檢測各種免疫表型EBV的感染情況4分析鼻咽原發(fā)性淋巴瘤患者的血清EBVVCAIGA和EA19A滴度特點；5從石蠟包埋組織中抽提DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)PCR、巢式PCR及限制性內(nèi)切酶酶切分析及核酸序列分析等方法研究鼻咽結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤EBVLMPL基因及F片段的變異類型及其伴隨的點突變。睦蟹口木1鼻咽原發(fā)性淋巴瘤的發(fā)病情況及臨床病理特征11鼻咽原發(fā)性淋巴瘤占所有結(jié)外淋巴瘤的109％109／1005。男女比為203173／36，中位發(fā)病年齡為55歲128L歲，其中彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤DLBCL發(fā)病較結(jié)外鼻型NK／T細(xì)胞淋巴瘤晚11年中位發(fā)病年齡分別為615歲和505歲P245U／L。國際預(yù)后指數(shù)INTERNATIONALPROGNOSTICINDEX，IPI明確的共65例，II

簡介：該研究分為三個部分一、單堿基延伸法檢測乙肝病毒點突變的建立與優(yōu)化二、拉米夫定耐藥患者血清中HBVYMDD基序變異及與HBVDNA水平的關(guān)系三、乙型肝炎患者HBVDNA前C區(qū)突變株的檢測及其臨床意義一、單堿基延伸法檢測乙肝病毒點突變的建立與優(yōu)化目的建立一種簡便、快速并能檢測混合株組成的乙肝病毒點突變P基因區(qū)YMDD基序變異及前C區(qū)1896位變異的檢測方法結(jié)論單堿基延伸法是一種簡便、快速、靈敏度和特異性較高的點突變檢測方法且可以檢測混合株中各成份構(gòu)成比率二、拉米夫定耐藥患者血清中HBVYMDD基序變異及與HBVDNA水平的關(guān)系目的研究拉米夫定耐藥患者血清中HBVDNAYMDD基序第741位及第743位核苷酸變異情況并探討出現(xiàn)拉米夫定耐藥時YMDD變異株檢出率與HBVDNA水平的關(guān)系結(jié)論在拉米夫定耐藥患者血清中YMDD變異株與野生株HBVDNA定量并無統(tǒng)計學(xué)差異提示在出現(xiàn)YMDD變異時繼續(xù)予拉米夫定治療可能仍可控制HBVDNA于較低的病毒復(fù)制水平三、乙型肝炎患者HBVDNA及C區(qū)突變株的檢測及其臨床意義目的研究乙型肝炎患者中HBVDNA前C區(qū)1896位變異及其與HBVDNA水平、E抗原轉(zhuǎn)換及病情嚴(yán)重程度的關(guān)系結(jié)論HBV前C區(qū)1896位變異株在慢性乙型肝炎患者血清中的存在是比較普遍的野生株與變異株之間的比率是動態(tài)變化的變異株的檢出率與HBVDNA水平無明顯相關(guān)性變異株的檢出率隨著肝炎的病情加重而增多但二者可能為一種伴隨關(guān)系而非因果關(guān)系

簡介：南方醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文VCI與NTIS大鼠中樞甲狀腺功能及轉(zhuǎn)運蛋白OATP1C1、MCT8MRNA水平與認(rèn)知關(guān)系研究姓名袁大華申請學(xué)位級別碩士專業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師王群20090510中文摘要研究方法1實驗分組26只SPF成年SD大鼠，性別不限，隨機(jī)分為三組正常對照組9只；慢性腦缺血致VCI組7只永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈5周；腦外疾病慢性肝纖維化致NTIS組I0只四氯化碳，玉米油L6稀釋，腹腔注射，3次／周，共8周。2各組大鼠于實驗終點進(jìn)行MORRIS水迷宮測試，進(jìn)行定位航行試驗、空間探索試驗。3NTIS大鼠試驗終點對取肝臟，用10％中性緩沖甲醛溶液保存，制作蠟塊，行HE染色。4各組大鼠均于實驗終點應(yīng)用放射免疫法測定血清T。、T。、FT。、FT、RT。、TSH、TRH濃度和腦組織中T。、T。、RT，濃度。5各組大鼠均于實驗終點采用熒光定量PCR法測定腦組織中TH轉(zhuǎn)運蛋白OATPLCLMRNA和MCT8MRNA的表達(dá)水平。6統(tǒng)計方法運用SPSSI15統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)以均值標(biāo)準(zhǔn)差I(lǐng)S表示。定向航行實驗逃避潛伏期的測量結(jié)果使用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的多因素方差分析。多個獨立樣本的比較用單因素方差ONEWAYANOVA分析，多重比較采用LSD法進(jìn)行分析。以尸O05為差異顯著性檢驗界限。研究結(jié)果一NTIS組大鼠肝臟病理學(xué)HE染色，200倍光鏡下NTIS組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)尚存在，肝細(xì)胞腫脹排列成索狀，部分胞漿內(nèi)有膽汁淤積，匯管區(qū)慢性炎細(xì)胞浸潤伴纖維組織增生，部分纖維組織伸入肝小葉內(nèi)，將肝小葉分割呈結(jié)節(jié)狀，局灶假小葉形成。二水迷宮結(jié)果通過MORRIS水迷宮測試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VCI組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低1定向航行測定三組間逃避潛伏期差異有統(tǒng)計學(xué)意義F4783，PO024。進(jìn)一步多重分析，VCI組較NTIS組和正常組逃避潛伏期顯著延長尸0026，PⅡ

簡介：目的通過對先天性無癥狀巨細(xì)胞病毒CYTOMEGALOVIRUS，CMV感染患兒進(jìn)行隨訪，觀察先天性無癥狀巨細(xì)胞病毒感染患兒免疫狀態(tài)變化規(guī)律、尿CMVDNA定量與患兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷情況的關(guān)系。方法以2007年2月～2008年10月青島市婦女兒童醫(yī)療保健中心產(chǎn)科及新生兒科住院新生兒為研究對象，生后14天內(nèi)采集尿進(jìn)行CMVDNA監(jiān)測，確診先天性無癥狀巨細(xì)胞病毒感染患兒75例作為研究組，選擇同期非HCMV感染新生兒35例為對照組。在研究對象14天內(nèi)、1月、2月、3月、6月時進(jìn)行隨訪。熒光定量FQPCR檢測HCMVDNA，以畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射DPOAE即耳聲發(fā)設(shè)法OTOACOUSTICEMISSION，OAE和腦干聽覺誘發(fā)電位BRAINSTEMAUDITYEVOKEDPOTENTIAL，BAEP，也稱聽覺腦干反應(yīng)AUDITYBRAINSTEMRESPONSE，ABR測試進(jìn)行聽力篩查，采集外周血2ML，采用單克隆抗體標(biāo)記的間接ABC免疫法，檢測外周血T細(xì)胞亞群明確機(jī)體細(xì)胞免疫功能，應(yīng)用ELISA法檢測112，IL6及ΓIFN水平。結(jié)果114天內(nèi)先天性無癥狀HCMV感染組CD3、CD4、CD8、CD4CD8均值略低。1月、2月、3月、6月時先天性無癥狀HCMV感染組CD4、CD3、CD4CD8均值略低，CD8增高，但與對照組比較差異不顯著P005。214天內(nèi)先天性無癥狀HCMV感染組TL2，IL6及ΓIFN均值增高。1月、2月、3月、6月時先天性無癥狀HCMV感染組IL2，IL6及ΓIFN均值增高，但與對照組比較差異不顯著P005。3尿CMVDNA定量與細(xì)胞免疫狀態(tài)的關(guān)系HCMV無癥狀感染組患兒尿HCMVDNA數(shù)量大于105COPIESML較小于10SCOPIESML的患兒及對照組CD4、CD3、CD4CD8均值降低較其它兩組更明顯，說明隨著尿HCMVDNA數(shù)量的增加，CMV感染患兒的細(xì)胞免疫狀態(tài)有明顯變化。但統(tǒng)計學(xué)差異無顯著性P005。4尿HCMVDNA定量與細(xì)胞免疫狀態(tài)的關(guān)系HCMV無癥狀感染組患兒尿HCMVDNA數(shù)量大于10SCOPIESML較小于LOSCOPIESML的患兒IL2，IL6及ΓIFN均值增高，較其它兩組更明顯，說明隨著尿HCMVDNA數(shù)量的增加，HCMV感染患兒的細(xì)胞因子狀態(tài)有明顯變化。但統(tǒng)計學(xué)差異無顯著性P005。結(jié)論先天性無癥狀巨細(xì)胞感染患兒存在神經(jīng)性耳聾，并呈進(jìn)行性和波動性，患兒HCMVDNA定量檢測與聽力損害存在一定的關(guān)系，特別是大于105時，神經(jīng)損害發(fā)生的機(jī)率明顯增加。先天性無癥狀巨細(xì)胞病毒感染患兒的免疫狀態(tài)發(fā)生變化，免疫功能明顯降低。隨著HCMVDNA定量的增加，免疫功能減低更加明顯。

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簡介：中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文天皰瘡、大皰性類天皰瘡和尋常型銀屑病與Ⅰ型單純皰疹病毒、人類皰疹病毒8的相關(guān)性研究姓名王官清申請學(xué)位級別博士專業(yè)皮膚病與性病學(xué)指導(dǎo)教師陳洪鐸200141份、外周靜脈血16份、血清22份。38例大皰性類天皰瘡患者的皮損24份、外周靜脈血12份、血清9份。2、DNA提取以及DNA濃度測定與調(diào)定1、外間靜脈血以紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后分離PBMCS。2、以經(jīng)典的酚一氯仿抽提法提取獻(xiàn)血員PBMCS以及天皰瘡、大皰性類天皰瘡和尋常型銀屑病患者的皮損、PBMCS，和尋常型銀屑病患者咽拭子中的DNA。3、提取的DNA用紫外分光光度計測定260HM和280NM的光密度OD，并根據(jù)此OD值計算DNA的濃度和純度，然后用TE緩沖液調(diào)濃度至0IPG／一O3、引物設(shè)計1、HHV一8DNP引物以HHV一8高度保守基因一DNA聚合酶DNP基因為模板設(shè)計一套巢式PCR引物GQI／GQ2和OQ310Q4。2、HHV一8KS330引物以HHV一8特異性片段一KS330BAM為模板，設(shè)計另一套巢式PCR引物KSI／KS2和NSI／NS2。3、HSVI引物一PVL245以HSVI高度保守基因一DNA聚合酶DNP基因為模板設(shè)計一對單循環(huán)PCR引物。4、PCR擴(kuò)增1、用HHV8DNP引物做巢式PCR擴(kuò)增以檢測獻(xiàn)血員PBMCS，以及天皰瘡、大皰性類天皰瘡和尋常型銀屑病患者皮損、PBMCS和咽拭子中的HHV一8DNP片段。2、用HHV一8KS330引物做巢式PCR擴(kuò)增以檢測獻(xiàn)血員PBMCS，以及天皰瘡、大皰性類天皰瘡和尋常型銀屑病患者皮損、PBMCS和咽拭子中的HHV一8KS330片段。3、用HSV二I引物PVL245作單循環(huán)PCR擴(kuò)增以檢測天皰瘡、大皰性類天皰瘡和尋常型銀屑病患者皮損、PBMCS和咽拭子中的HSVIDNP片段。5、PCR產(chǎn)物的回收用DINA片段回收試劑盒回收用以PVL245擴(kuò)增的518BP產(chǎn)物、C_Q3／CQ4擴(kuò)增的229BP產(chǎn)物、KSI／KS2擴(kuò)增的233BP產(chǎn)物以及NSI／NS2擴(kuò)增的160BP產(chǎn)物?；厥盏钠斡糜谙拗菩詢?nèi)切酶分析和測序。2

簡介：中西醫(yī)結(jié)合治療小嬰兒巨細(xì)胞病毒肝炎51例療效觀察EFFECTOFINTEGRATEDTRADITIONALANDWESTERNMEDCINETREATMENTOFCYTOMEGALOVIRUSHEPATITISON51CASESIN●，’INTANTS導(dǎo)二級學(xué)科2生型堂論文課題起止時間2QQ生旦二至Q12生2旦中國醫(yī)科大學(xué)遼寧2012年4月目錄摘要中文論著摘要L英文論著摘要2英文縮略語4論文前。言5刖舌5資料與方法5結(jié)果6討論7結(jié)論8本研究創(chuàng)新性的自我評價9參考文獻(xiàn)10附錄綜J苤12在學(xué)期間科研成績22致謝O0000OOOOOBB23個人簡介24，，，，，，一二三四五穴

簡介：目的乙型肝炎病毒復(fù)發(fā)感染是影響肝移植受者的長期生存的重要因素之一。大劑量運用乙肝免疫球蛋白HBIG是預(yù)防HBV復(fù)發(fā)較有效的方法，但是其實際臨床應(yīng)用受到多種因素限制。全人源化基因工程抗體片段ANTIHBSFAB由乙肝表面抗體HBSAB重鏈FD段和完整的輕鏈組成，是完整抗體的13，僅有一個抗原結(jié)合位點。它屬于小分子抗體，具有許多血源性抗體無法比擬的優(yōu)點。本研究擬構(gòu)建、生產(chǎn)和純化攜帶全人源化ANTIHBSFAB基因的1型重組腺相關(guān)病毒RAAV1HBSFAB；建立該基因工程小分子抗體的體內(nèi)外真核表達(dá)體系并檢測其體外預(yù)防HBV感染的功能。結(jié)論成功構(gòu)建攜帶全人源化ANTIHBSFAB基因的1型重組腺相關(guān)病毒RAAV1HBSFAB；基因工程小分子抗體ANTIHBSFAB可在體內(nèi)外轉(zhuǎn)染PXXUF1HBSFAB的真核細(xì)胞中分泌性表達(dá)，并能通過腎小球濾過代謝；ANTIHBSFAB在體外具有預(yù)防HBV感染肝細(xì)胞的能力。為進(jìn)一步研究RAAV1HBSFAB在預(yù)防肝移植后乙肝復(fù)發(fā)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

簡介：點擊查看更多寧波地區(qū)護(hù)士職業(yè)認(rèn)知現(xiàn)狀及職業(yè)倦怠度調(diào)查.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：現(xiàn)有的乙肝基因工程疫苗含S抗原接種后約10接種者為免疫無應(yīng)答者而使用增加了PRES2抗原的中蛋白疫苗含S和PRES2抗原可減少免疫無應(yīng)答者的出現(xiàn)霍亂毒素B亞基CTB具有很強(qiáng)的免疫原性能刺激機(jī)體產(chǎn)生粘膜IGA和血清IGG抗體它在免疫佐劑、口服疫苗與多肽疫苗的研究中具有越來越重要的作用為了獲得能夠口服吸收的并能引起免疫應(yīng)答的融合蛋白該研究利用基因工程方法將霍亂毒素B亞基乙肝中蛋白融合基因在家蠶桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)首先將霍亂毒素B亞基與乙肝中蛋白基因的重組到轉(zhuǎn)移載體PBACPAK8獲得含有霍亂毒素B亞基與乙肝中蛋白融合基因的重組轉(zhuǎn)移載體PBACPAKCTBHBM并與已線性化的病毒BMBACPAK6DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞篩選出重組病毒BACPAKCTBHBM將重組病毒BACPAKCTBHBM以10PFU細(xì)胞感染家蠶家蠶培養(yǎng)細(xì)胞和幼蟲WESTERN印跡方法表明表達(dá)產(chǎn)物大小約為43KD用ELISA法測定表達(dá)產(chǎn)物的抗原性結(jié)果顯示家蠶培養(yǎng)細(xì)胞的胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的抗原反應(yīng)性重組病毒BACPAKCTBHBM感染的家蠶培養(yǎng)細(xì)胞第48H的表達(dá)量最高量約161UGMLBACPAKCTBHBM感染的家蠶蛹血淋巴也具有明顯的抗原反應(yīng)性第120H的表達(dá)量最高量約1527UGML將表達(dá)產(chǎn)物免疫動物后用ELISA法測定表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性結(jié)果顯示在口服初免方式中連續(xù)攝入六周后停止攝入后四周開始檢測抗體融合蛋白組有60的鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗HBS抗體中蛋白組20的鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗HBS抗體在抗HBS抗體陽轉(zhuǎn)的鼠體內(nèi)也檢測到了相應(yīng)的抗PRES2抗體口服加強(qiáng)免疫在商用疫苗初免后抗體水平下降到PN值低于50時連續(xù)攝入表達(dá)產(chǎn)物四周后檢測抗體融合蛋白組和中蛋白組全部檢測到抗HBS抗體抗體水平逐漸增強(qiáng)而且抗體水平持續(xù)維持在較高水平

簡介：目的乙肝病毒核心蛋白可自我組裝成病毒樣顆粒VLP，HBCVLP作為表位遞呈系統(tǒng)可用于攜帶外源表位。除了應(yīng)用于VLP疫苗和表位疫苗以外，VLP還可用于病毒顆粒的攝取，病毒藥物活性以及樹突狀細(xì)胞DCS的抗原遞呈功能等研究中。然而，發(fā)現(xiàn)一些商業(yè)化單克隆抗體并不能特異性識別HBCVLP，同樣也無法應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)病毒樣顆粒的定位研究，于是不得不購買大量單抗以找到一種合適的，這一過程無疑費力又費錢。因次，要制備出一個HBCVLP特異性多功能單克隆抗體以滿足多種研究的不同需要。方法①構(gòu)建與表達(dá)HBV核心抗原截短的HBC基因AA1144通過PCR擴(kuò)增而來，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后，轉(zhuǎn)入表達(dá)載體PET28A。陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BL21DE3大腸桿菌菌株，用IPTG誘導(dǎo)；②快速純化重組HBC蛋白離心獲得濕重為9克的菌體，重懸加入溶菌酶后超聲破菌獲得包含體。將包含體加入10ML變性緩沖液50MMTRISHCL，PH80和01M尿素，不能溶解的成分通過離心30MIN12000G去除。用復(fù)性緩沖液稀釋至2MGML的濃度。復(fù)性蛋白溶液用雙蒸水PH60透析以去除殘留的尿素。并用SDSPAGE確定其純度；③電鏡分析所制備的VLP；④制備抗HBCVLP單克隆抗體用HBCVLPAA1144作為免疫原來免疫BALBC雌鼠。經(jīng)過幾次免疫后，將抗體滴度高的BALBC鼠的脾細(xì)胞與SP20骨髓瘤細(xì)胞融合。先用ELISA篩選，再進(jìn)行WESTEM印跡分析以進(jìn)一步篩選，獲得HBCVLP特異性抗體；⑤鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW2647的吞噬作用的檢測；⑥利用共聚焦激光掃描顯微鏡對HBCVLP表位疫苗的攝取過程進(jìn)行觀察；⑦HEPG2215細(xì)胞中活HBV的觀察將HEPG2215細(xì)胞接種于玻片上并培養(yǎng)，以觀察先前所篩選的陽性單抗是否能與自然病毒顆粒反應(yīng)。HEPG2細(xì)胞作為陰性對照。結(jié)果①成功構(gòu)建了PET28AHBCAA1144，經(jīng)SDSPAGE分析，其所表達(dá)的目的蛋白分子量為19KDA；②經(jīng)WESTERN印跡分析驗證該目的蛋白的確具備HBC抗原的免疫原性；③01M尿素所溶解的HBC蛋白可形成病毒樣顆粒；經(jīng)超純水透析后的HBCVLP的結(jié)構(gòu)更加規(guī)則統(tǒng)一；④用HBCVLP作為免疫原來免疫BALBC雌鼠通過ELISA和WESTERN印跡分析篩選到5個HBCVLP特異性抗體；⑤篩選到3個可與被APC攝取的HBCVLP相結(jié)合的特異性單抗。這三個單抗的編號分別為3H2D7F6，1H7D7D2和3B8E6D3；⑥利用HEPG2215細(xì)胞系篩選到1個單抗能特異性結(jié)合自然狀態(tài)下的HBC顆粒，此單抗編號為3H2D7F6。結(jié)論①以截短的HBCVLP骨架作免疫原，以此表位遞呈系統(tǒng)為篩選平臺，最終篩選出1個可用于鑒定HBCVLP，嵌合體HBCVLP疫苗和細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒衣殼蛋白的抗體。該抗體具備多功能抗HBCVLP作用，應(yīng)用此多功能單抗可節(jié)約大量經(jīng)費。②構(gòu)建與表達(dá)的目的蛋白具有HBC抗原的免疫原性。③01M尿素所溶解的HBC蛋白可形成病毒樣顆粒。