HBx蛋白和CIITA轉錄表現遺傳沉默在調控HepG2與L02細胞HLA-DR表達中的作用研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染已成為全球范圍的嚴重公共衛(wèi)生問題。HBV感染與原發(fā)性肝細胞癌關系密切，是我國原發(fā)性肝細胞癌的主要病因之一，而HBV感染導致肝癌發(fā)生、發(fā)展的確切機制至今尚未闡明。
　　 宿主免疫應答水平是影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉歸的主要因素之一。肝癌細胞免疫逃逸在原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，探討肝癌細胞的免疫逃逸機制有助于制定針對肝癌免疫治療的策略。主要組織相容性Ⅱ類分子(m

2、ajor histocompatibilitycomplexⅡ，MHC-Ⅱ)通過向Th細胞提呈外來抗原，在抗感染和抗腫瘤免疫中起重要作用?，F有研究表明，腫瘤細胞缺乏HLA-DR(human leukocyte antigen DR，HLA-DR)表達是乳腺癌、結腸癌等發(fā)生免疫逃逸的重要機制之一。Ⅱ類反式激活因子(ClassⅡtransactivator，CIITA)是調控HLA-DR表達的“限速因子”，在調控HLA-DR表達與否及水平中

3、起決定作用。報道指出，胃癌、結腸癌等腫瘤細胞中CIITA表達缺失是其缺乏誘導性HLA-DR表達的關鍵機制。我們以前的研究發(fā)現，HBV相關原發(fā)性肝細胞癌患者癌組織中的肝癌細胞缺乏CIITA與HLA-DR表達，而相應的癌周肝組織中的肝細胞存在不同程度的CIITA與HLA-DR表達，提示肝癌細胞缺乏HLA-DR表達可能與CIITA基因表達沉默有關、并在肝癌細胞免疫逃逸中起重要作用。然而，肝癌細胞CIITA基因表達沉默的機制尚未闡明。
　

4、　 宿主基因啟動子DNA甲基化和/或組蛋白的去乙?；菍е滤拗骰虮磉_沉默的重要機制。已有研究顯示，部分腫瘤細胞CIITA啟動子Ⅳ甲基化和/或組蛋白去乙?；菍е履[瘤細胞CIITA表達沉默和HLA-DR表達缺乏的關鍵表觀遺傳機制。在不同的腫瘤細胞中，導致CIITA基因轉錄沉默的表觀遺傳機制存在差異，在黑色素瘤細胞中由其啟動子Ⅳ組蛋白去乙酰化所致，與甲基化無關；在胃癌、結腸癌細胞中則由其啟動子Ⅳ甲基化單獨所致；在白血病細胞中則由其啟動子

5、Ⅳ甲基化和組蛋白去乙酰化共同調控。在肝癌細胞中，與HLA-DR表達缺失相關的CIITA基因表觀遺傳沉默機制目前尚缺少研究。
　　 HBV基因組含有4個開放讀碼框架，其中X區(qū)所編碼的產物HBx蛋白是一種多功能的調節(jié)蛋白，具有廣泛的反式激活功能，既可激活信號轉導系統(tǒng)，又可直接作用于細胞轉錄因子，還能通過上調DNA甲基轉移酶和組蛋白去乙?；傅鹊谋磉_參與宿主基因的表觀遺傳調節(jié)，導致宿主基因的表觀遺傳沉默。近年研究發(fā)現X基因及其產物X蛋

6、白與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生密切相關，而HBx蛋白對抑癌基因的表觀遺傳修飾調控導致的基因沉默被認為是原發(fā)性肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展的重要機制。由此推測，HBx蛋白有可能通過上調DNA甲基轉移酶和組蛋白去乙酰化酶等的表達參與誘導肝細胞或肝癌細胞CIITA基因轉錄表觀遺傳沉默。然而，HBx蛋白在調控肝細胞CIITA基因轉錄表觀遺傳沉默與HLA-DR表達中的作用尚無研究報道。
　　 首先，我們檢測人正常肝細胞株L02細胞和人肝癌細胞株HepG2

7、細胞中基礎性及IFN-γ誘導性CIITA和HLA-DR的表達狀況，并分析CIITA基因cDNA轉染對HepG2細胞HLA-DR表達的影響，從而探討HepG2細胞缺乏HLA-DR表達與CIITA基因表達沉默的關系；然后，采用MSP和ChIP技術檢測L02細胞和HepG2細胞中CIITA啟動子Ⅳ的DNA甲基化和組蛋白H3乙酰化狀態(tài)，并分析甲基轉移酶抑制劑5-Aza-CdR和組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA對HepG2細胞CIITA與HLA-DR

8、表達的影響，從而探討CIITA啟動子Ⅳ DNA甲基化和組蛋白H3去乙酰化在調控HepG2細胞CIITA與HLA-DR表達中的作用；最后，構建HBV X基因真核表達載體，并分別轉染L02細胞與HepG2細胞，探討HBx蛋白對L02細胞與HepG2細胞CIITA和HLA-DR表達的影響。
　　 主要研究結果
　　 1、L02細胞中未檢測到CIITA和HLA-DR的基礎性表達，通過IFN-γ的刺激后檢測到了CIITA和HLA-

9、DR mRNA和蛋白的表達，且CIITA和HLA-DR的表達與IFN-γ呈一定的時間劑量依賴關系。HepG2細胞中，則未檢測到CIITA和HLA-DR的基礎性及IFN-γ誘導性表達。通過將CIITA真核表達載體轉染HepG2細胞后，檢測到HLA-DR的表達，轉染空載體及HepG2細胞本身未檢測到HLA-DR的表達。
　　 2、L02細胞中CIITA啟動子Ⅳ DNA呈非甲基化狀態(tài)，組蛋白H3呈乙酰化狀態(tài)，HepG2細胞中CIITA

10、啟動子Ⅳ DNA呈半甲基化狀態(tài)，組蛋白H3呈去乙?；癄顟B(tài)。通過采用DNA甲基轉移酶抑制劑5-Aza-CdR和組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA單獨及聯合處理HepG2細胞后，結果顯示TSA和5-Aza-CdR單獨處理及兩者聯合處理，均能恢復IFN-γ誘導性CIITA mRNA的表達，以TSA單獨處理組相對定量為1，5-Aza-CdR單獨處理組相對值為1.15±0.27，兩者聯合處理組相對定量值為2.13±0.22，顯著高于單獨處理組，P<0.

11、05；經5-Aza-CdR處理后恢復了HLA-DR蛋白的誘導性表達，經流式細胞技術檢測，其表達率達11.9%±1.78%；經TSA處理后，HLA-DR蛋白的誘導性表達率達9.31%±2.24%；經兩者聯合處理后，HLA-DR蛋白的誘導性表達率達28.5%±2.81%，較兩者單獨處理明顯升高(P<0.05)。
　　 3、構建HBV X基因真核表達載體，通過電穿孔方法轉染L02細胞和HepG2細胞后，轉染了HBVX基因的L02細胞中

12、檢測到了CIITA和HLA-DR的表達，同時，轉染了HBV X基因的HepG2也檢測到了HLA-DR的表達。
　　 結論
　　 1、CIITA基因表達沉默是導致HepG2細胞缺乏基礎性與IFN-γ誘導性HLA-DR表達的關鍵機制；
　　 2、CIITA啟動子Ⅳ的DNA甲基化和組蛋白H3去乙?；揎椩趯е翲epG2細胞CHTA基因轉錄表觀遺傳沉默及HLA-DR表達缺失中均起重要作用，并可能是導致肝癌細胞免疫逃逸的重