鴨源黃病毒的分離鑒定及生物學特性初步研究.pdf

1、2010年6月以來，我國部分地區(qū)蛋鴨養(yǎng)殖場暴發(fā)了一種傳染病，以產蛋率突然急劇下降為特點，剖檢發(fā)病鴨以出血性卵巢炎為共癥，并迅速在我國大部分地區(qū)蔓延，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經濟損失。為了解引發(fā)該病的病原及其生物學特性，對安徽地區(qū)2010年流行的發(fā)病鴨進行了病原分離及PCR檢測，并對分離毒株進行了基因序列測定及分析，鑒定為鴨源黃病毒并命名為鴨源黃病毒AH-F10株。利用安徽分離株鴨源黃病毒AH-F10制備油乳劑滅活疫苗，并進行免疫攻毒保護

2、試驗，為預防和控制鴨源黃病毒病提供技術支持和保障。
　　 首先，從發(fā)病鴨病變組織進行致病原的分離鑒定。無菌條件下采集產蛋下降病鴨卵巢、輸卵管等組織制成研磨液，過濾除菌。通過尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚進行病毒分離。96h內收集尿囊液，利用RT-PCR對其進行鑒定。結果表明：在pH值為7.2的條件下，雞胚分離物對1％的雞、鴨紅細胞無凝集性。RT-PCR鑒定結果表明，雞胚分離物鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒、新城疫病毒PCR呈陰性，但擴增

3、出黃病毒NS1基因部分序列，其大小為260bp。測序結果分析表明其與黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群的巴格扎病毒(Bagaza virus)病毒具有相近的遺傳進化關系，與國內鴨源黃病毒核苷酸同源性達99％。由此可見，本次試驗初步分離獲得了一株鴨源黃病毒，命名為鴨源黃病毒AH-F10株。證明安徽省已經存在鴨源黃病毒的感染。
　　 其次，對分離株進行雞胚、鴨胚的致病性試驗。將分離得到的鴨源黃病毒AH-F10株通過尿囊腔分別接種10日齡S

4、PF雞胚(0.2ml/枚)和11日齡鴨胚(0.2ml/枚)進行傳代培養(yǎng)。雞胚傳代培養(yǎng)結果發(fā)現，96h內第一代雞胚無死亡，第二代30％(3/10)雞胚死亡，第三代60％(6/10)雞胚死亡。剖檢發(fā)現：雞胚尿囊膜增厚，肝臟點狀出血，斑駁狀壞死，有的肝臟邊緣有白色壞死灶；鴨胚肝臟土黃色，腫大出血。結果表明：鴨源黃病毒AH-F10株可通過SPF雞胚和鴨胚進行傳代培養(yǎng)，且隨著雞胚傳代次數的增加，其毒力不斷增強。
　　 第三，分離株對雞胚成

5、纖維細胞的致病性試驗。取10日齡SPF雞胚，常規(guī)制作雞胚原代成纖維細胞，將分離得到的鴨源黃病毒AH-F10株接種于雞胚成纖細胞。24h時發(fā)現細胞開始出現圓縮，48h圓縮細胞增多，72h細胞開始脫落死亡，并且細胞折光性增強。結果表明鴨源黃病毒AH-F10株可以在CEF上傳代培養(yǎng)，并可以引起細胞病變。
　　 最后，鴨源黃病毒AH-F10株油乳劑滅活疫苗的制備及其免疫攻毒保護試驗。利用安徽分離株鴨源黃病毒AH-F10，經一定濃度的的甲

6、醛滅活后，與白油、司盤-80、吐溫-80，按一定的比例混合，制備成鴨源黃病毒AH-F10油乳劑滅活疫苗，并對其進行物理性狀、無菌檢驗、安全性檢驗、穩(wěn)定性檢驗，檢驗結果合格。免疫攻毒保護試驗：28周齡產蛋麻鴨隨機分為四組，每組5只，分別為A免疫攻毒組、B攻毒組、C免疫組、D對照組；第1d時，A、C兩組試驗鴨均采用頸部皮下和肌肉注射方法免疫接種鴨源黃病毒AH-F10油乳劑滅活疫苗，劑量1ml/只；B、D組以同樣的方法與劑量注射無菌生理鹽水。

7、第14d時，A、B兩組仍按上述方法接種鴨源黃病毒AH-F10病毒液，劑量為1ml/只。結果：B組在攻毒后第3d產蛋開始下降，第6d攻毒組鴨停止產蛋，持續(xù)到第20d后又產蛋1枚。剖檢可見攻毒組鴨卵泡出現變性、萎縮、出血現象。提取卵巢、卵泡病變組織病毒RNA后，經RT-PCR檢測鴨源黃病毒結果陽性。而A免疫攻毒組、C免疫組以及D對照組接種鴨產蛋及剖檢結果均正常，RT-PCR檢測結果鴨源黃病毒陰性。試驗證明，鴨源黃病毒AH-F10株油乳劑滅活