基于熒光蛋白的蛋白酶和蛋白激酶檢測(cè)新方法.pdf

1、蛋白酶和蛋白激酶普遍存在于生物體內(nèi)并參與各項(xiàng)生命活動(dòng)，對(duì)蛋白酶和蛋白激酶的檢測(cè)不僅能使我們更好的理解生命過(guò)程，對(duì)于人們的生產(chǎn)生活、疾病的診斷治療方面都有著極大的意義。綠色熒光蛋白(GFP)是一種由238個(gè)氨基酸構(gòu)成的，在紫外光激發(fā)下能發(fā)射出強(qiáng)烈綠色熒光的蛋白。在細(xì)胞和分子生物學(xué)中，綠色熒光蛋白通?？梢酝ㄟ^(guò)分子克隆手段與其它分子在體內(nèi)體外融合構(gòu)建生物傳感器。與一般在體內(nèi)具有毒性的熒光小分子不同（如FITC），熒光蛋白對(duì)細(xì)胞的毒性較小，有很

2、好的生物相容性。這個(gè)優(yōu)勢(shì)促使了綠色熒光蛋白在生物檢測(cè)方面的應(yīng)用發(fā)展，如活體內(nèi)熒光成像，DNA/RNA標(biāo)記，或研究體內(nèi)外蛋白間的相互作用等。但目前熒光蛋白在蛋白酶和蛋白激酶活性檢測(cè)方面的應(yīng)用較少，所以急需開(kāi)發(fā)熒光蛋白在該方面的檢測(cè)方法。
　　 本論文利用重組加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced fluorescence protein，EGFP)和基于熒光蛋白的自組裝雙分子熒光互補(bǔ)對(duì)(self-assembling Bimolec

3、ularFluorescence Complementation，self-assembling BiFC)，開(kāi)發(fā)了兩種無(wú)標(biāo)記蛋白酶和蛋白激酶的熒光檢測(cè)方法。
　　 1、結(jié)合EGFP的自發(fā)熒光特性和鎳離子-氮三乙酸修飾的磁納米顆粒(Ni2+-NTAMNPs)的磁富集特性，開(kāi)發(fā)了一種無(wú)標(biāo)記、簡(jiǎn)單的凝血酶熒光檢測(cè)方法。N端帶有組氨酸標(biāo)簽(His-tag)和凝血酶識(shí)別位點(diǎn)的綠色熒光蛋白通過(guò)His tag-Ni2+-NTA之間的螯合作用

4、結(jié)合在Ni2+-NTA MNPs的表面，并在外界磁場(chǎng)存在下被Ni2+-NTAMNPs分離出上清液。當(dāng)凝血酶存在時(shí)，位于N端His-tag和EGFP序列間的凝血酶識(shí)別多肽被特異性切割，使EGFP與His-tag分離，不會(huì)被吸附到Ni2+-NTA MNPs表面，從而EGFP在外界磁場(chǎng)存在下仍然留在上清液中，使上清液熒光強(qiáng)度保持在較高水平。因此，該體系中上清液熒光的改變可以反應(yīng)體系中凝血酶的含量。在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，該方法對(duì)凝血酶有較低的檢

5、測(cè)限(3.0×10-4 U mL-1)，并用此方法檢測(cè)了凝血酶的抑制劑水蛭素(Hirudin)，也在人血清實(shí)際樣品中通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)添加的方法成功檢測(cè)了凝血酶活性。同時(shí)Ni2+-NTA MNPs的可重復(fù)利用性也說(shuō)明這是一種簡(jiǎn)單、靈敏、經(jīng)濟(jì)的凝血酶活性檢測(cè)方法，并有望于應(yīng)用在抗凝藥物的篩選中。
　　 2、通過(guò)酶切完整表達(dá)的綠色熒光蛋白，我們獲得了去除第十β片段(S10)后具有成熟發(fā)光基團(tuán)的綠色熒光蛋白大片段(truncated GFP)。

6、在用胰蛋白酶酶切完整綠色熒光蛋白后，分別使用鹽酸胍、SDS、尿素變性分離truncated GFP和S10，評(píng)估這三種變性劑的變性及隨后的分離效果，以及得到的大片段truncated GFP與合成的S10片段混合后的熒光恢復(fù)情況。
　　 3、基于第2個(gè)工作中構(gòu)建的自組裝雙分子熒光互補(bǔ)對(duì)truncated GFP和S10，并用多肽合成方法在S10的C端融合cAMP依賴(lài)蛋白激酶(cAMP-dependent proteinkinas