真菌生物堿Brevianamides的生物合成機(jī)制的研究.pdf

1、Brevianamides是一類由絲狀真菌青霉（Penicillium）或曲霉（Aspergillus）產(chǎn)生的異戊二烯基化吲哚類生物堿（prenylated indole alkaloids），該家族成員Brevianamide A與Brevianamide D對(duì)草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）與煙芽夜蛾（Heliothis virescens）等鱗翅目昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)具有顯著的抗蟲(chóng)活性。
　　對(duì)絲狀真菌短密青霉（

2、Penicillium brevicompactum NRRL864）的全基因組進(jìn)行分析，利用生物信息學(xué)方法，以Aspergillus versicolor產(chǎn)生的notoamide A的生物合成基因簇為探針，在短密青霉NRRL864基因組中挖掘出4個(gè)與真菌生物堿Brevianamide A生物合成相關(guān)的基因，并分析了其功能。以短密青霉NRRL864的cDNA為模板，利用PCR技術(shù)克隆得到了除BvnA外的其余3個(gè)基因，并將這3個(gè)基因分別克

3、隆至pET28b表達(dá)載體中。將3種構(gòu)建好的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）中，獲得了表達(dá)菌株，經(jīng)異丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)菌株大量累積相關(guān)基因的編碼蛋白。經(jīng)Ni2+-NTA樹(shù)脂親和層析，獲得了BvnB和BvnC編碼的重組可溶性蛋白，而B(niǎo)vnD編碼的重組蛋白則以包涵體的形式存在，在進(jìn)行了帶有助溶性標(biāo)簽的重組蛋白表達(dá)和凍融變復(fù)性法嘗試后，仍未能獲得可溶性蛋白。
　　對(duì)重組BvnC蛋白催

4、化反應(yīng)的底物特異性、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)以及酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在供試的十種化合物中，重組 BvnC僅能催化以Brevianamide F為底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。MS、NMR分析顯示，以二甲基丙烯基二磷酸（Dimethylallyl pyrophosphate）為供體，重組BvnC蛋白能特異性催化異戊烯基轉(zhuǎn)移至Brevianamide F的α位C上，生成Deoxybrevianamide E，驗(yàn)證了之前的推測(cè)。重組BvnC蛋白催化Bre