基于DNA雜交鏈反應(yīng)放大策略的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性及羥甲基化程度電化學(xué)分析.pdf

1、DNA甲基化是目前研究最多的DNA表觀遺傳修飾之一。DNA甲基化由DNA甲基轉(zhuǎn)化移酶催化完成的。由于DNA甲基化狀態(tài)是可被逆轉(zhuǎn)的，也就是存在DNA去甲基化過程，但相對于甲基化過程，去甲基化過程更加復(fù)雜。DNA的甲基化與去甲基化這兩個(gè)過程相互平衡，維持了DNA甲基化模式的穩(wěn)定。大量研究表明，許多重要的過程如胚胎發(fā)育和細(xì)胞周期調(diào)控都與甲基化息息相關(guān)，而多個(gè)癌癥也表現(xiàn)出異常的甲基化模式。因此，發(fā)展簡易、靈敏、準(zhǔn)確、可靠的用于定位、定量分析DN

2、A甲基化的方法是至關(guān)重要的。相對于其他方法，電化學(xué)擁有如檢測時(shí)間短、操作簡單、費(fèi)用低、易于小型化等諸多優(yōu)勢，是一種具有良好發(fā)展前景的分析測試方法。本論文旨在建立某些疾病DNA的電化學(xué)、去甲基化程度的電化學(xué)檢測方法，為某些疾病的臨床診斷和治療觀察提供準(zhǔn)確、快速和靈敏的方法。本論文的主要工作是通過DNA雜交鏈反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)DNA甲基化、去甲基化狀態(tài)及DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的電化學(xué)信號放大檢測。
　　1.DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（MTase）活性與腫

3、瘤發(fā)生，發(fā)展密切相關(guān)。本文建立了免標(biāo)記超結(jié)構(gòu)電化學(xué)方法用于信號放大檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性（例如使用M.SssI甲基化轉(zhuǎn)移酶）?？刂乒潭ㄔ诮痣姌O上低密度的DNA有利于形成DNA超結(jié)構(gòu)，從而有效地實(shí)現(xiàn)信號放大。以RuHex作為電化學(xué)信號分子，可以靜電吸附到雙鏈DNA上，實(shí)現(xiàn)了免標(biāo)記的電化學(xué)檢測。實(shí)驗(yàn)證明，使用差分脈沖伏安法(DPV)能夠有效的檢測DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性，線性范圍為0.5-120U/mL，信噪比為3時(shí)，檢出限為0.025U

4、/mL。此外，在細(xì)胞裂解液內(nèi)依然可以檢測甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性。同時(shí)，本文也證實(shí)了該方法應(yīng)用于快速估測和篩選甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，它可以有助于探索與甲基化相關(guān)的抗癌藥物。
　　2.DNA去甲基化過程是DNA甲基化的可逆過程，研究發(fā)現(xiàn)，5-甲基胞嘧啶(5mC)在TET酶的催化氧化作用下生成5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)，5hmC的發(fā)現(xiàn)為DNA去甲基化研究提供了新的思路。且5hmC在體細(xì)胞重編程，胚胎發(fā)育和啟動(dòng)哺乳動(dòng)物DNA去甲基化中有重要作

5、用。因此檢測DNA樣品中5hmC的含量是十分必要的。在本文中，我們建立了基于DNA雜交鏈反應(yīng)(HCR)信號擴(kuò)增電化學(xué)方法用來有效的量化DNA羥甲基化程度。當(dāng)DNA序列中羥基化的胞嘧啶在UDP-glucose存在下被T4-βGT作用形成5ghmC，并阻礙MspJI識別剪切，經(jīng)輔助DNA(FcA-S3&S4)雜交作用后，與吸附到DNA鏈上的RuHex形成電子轉(zhuǎn)移通道，使信號放大。(I2-I0/I1-I0)代表雙鏈DNA羥基化比例，實(shí)驗(yàn)證明，