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文檔簡介
1、研究目的:
1、強啡肽鎮(zhèn)痛效應強、安全性好、無呼吸抑制和成癮性等優(yōu)勢,是目前生物鎮(zhèn)痛研究的重點。探討慢病毒介導的大鼠前強啡肽(PDYN)基因在骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)中的表達,為后續(xù)研究大鼠癌痛模型的生物鎮(zhèn)痛提供條件。
2、探討脊髓鞘內注射前強啡肽基因(PDYN)修飾骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)治療骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應。
研究方法:
1、采用貼壁篩選法分離和擴增BM-MSCs,流式
2、細胞學和體外成脂、成骨細胞誘導分化實驗鑒定。構建大鼠PDYN慢病毒載體并感染BM-MSCs,倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達和 Western blot法篩選最適感染復數(MOI);實驗分為空白組(BM-MSCs)、實驗組(PCDH-CMV-PDYN-EF1-copGFP)、空載體(PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP),采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)和Western blot檢測PDYN表達變化,采
3、用免疫細胞化學染色法檢測強啡肽(DYN)蛋白表達。
2、將含5×106/ml MADB-106大鼠乳腺癌細胞注射到SD大鼠脛骨靠近干骺端骨髓腔,制作骨癌痛模型(B組),同時設對照組(C組,n=8)。所有大鼠于術前1天、術后3、5、7、10、14天測定熱刺激縮足潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWL)、自由行走痛評分、機械刺激縮足閾值(paw withdrawal mechanical th
4、reshold,PWT)疼痛行為學指標。骨癌痛模型制備成功的B組(n=24)采用隨機數字法均分為3組,分別鞘內注射無菌生理鹽水20μl(B1組)、鞘內注射BMSCs-VESTOR細胞懸液20μl(B2組)、注射BMSCs-PDYN細胞懸液20μl(B3組)。鞘內注射后3、5、7、10、14天檢測疼痛行為學指標,最后一次行為學檢測后處死大鼠并取L4-6節(jié)段脊髓組織,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)測定PDYN mRNA
5、表達,Western Blot和石蠟切片免疫組化測定脊髓背角強啡肽(DYN)蛋白表達。另采用裸鼠致瘤實驗檢驗該細胞系的安全性。
研究結果:
1、BM-MSCs呈長梭形纖維細胞樣貼壁生長,多數表達CD29、CD44、CD90,少數表達CD45。成脂誘導培養(yǎng)后油紅O染色為陽性;成骨誘導培養(yǎng)后出現礦化結節(jié),經茜素紅染色呈橘紅色。流式細胞儀檢測示BM-MSCs細胞中CD29、CD90、CD44、CD45陽性率分別為(99.8
6、0±0.19)%、(99.62±0.24)%、(96.86±1.27)%、(0.82±0.06)%,轉染PDYN基因后BM-MSCs表面標記CD29、CD90、CD44、CD45陽性率分別為(99.59±0.34)%、(98.06±1.51)%、(95.23±0.71)%、(10.23±0.59)%。轉染前后BM-MSCs干細胞特性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。經PCR擴增克隆測序鑒定慢病毒載體PCDH-CMV-PDYN-EF1-c
7、opGFP構建成功,重組慢病毒滴度為5×106IU/mL。綠色熒光蛋白的表達和Western blot結果示慢病毒MOI=100為最佳病毒感染復數。qPCR、Western blot檢測到經慢病毒載體感染后的BM-MSCs中PDYN基因表達均上調(P<0.05),免疫細胞化學染色檢測顯示DYN蛋白表達顯著增強。
2、與C組和術前基礎值相比,B組大鼠在造模術后5天PWL逐漸縮短(P<0.05),PWT顯著降低(P<0.05),自
8、由行走痛評分逐漸升高(P<0.05),術后14天差異尤為明顯(P<0.05);B組間經鞘內注射處理后,B3組PWL逐漸延長(P<0.05),自由行走痛評分降低(P<0.05),PWT逐漸升高(P<0.05),而B1組和B2組在鞘內注射前后無顯著變化(P>0.05)。B組大鼠脊髓組織的PDYN mRNA表達均高于C組(P<0.05),且B3組較B1組、B2組PDYN mRNA表達顯著上調(P<0.05)。Western Blot和石蠟切片
9、免疫組化結果顯示B組與C組比較DYN蛋白表達顯著增強(P<0.05),B3組較B1組、B2組DYN蛋白表達顯著增強(P<0.05),B1組和B2組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。裸鼠致瘤實驗表明注入BMSCs-PDYN細胞系未發(fā)現致瘤性。
研究結論:
1、成功培養(yǎng)BM-MSCs和構建大鼠PDYN基因過表達慢病毒載體,在BM-MSCs中能高效穩(wěn)定表達PDYN基因和分泌DYN蛋白。
2、鞘內注射前強啡肽基因修
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