間歇性堿刺激對高磷誘導的大鼠血管平滑肌細胞鈣化的影響及機制研究.pdf

1、目的：維持性血液透析(maintenance hemodialysis, MHD)患者的全因死亡率逐年上升，其中心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)是MHD患者的主要死亡原因之一，而血管鈣化是其最常見的病理表現(xiàn)，據(jù)統(tǒng)計表明，血管鈣化導致的死亡率約占MHD患者總病死率的30％左右。影響MHD患者血管鈣化的危險因素眾多，如高齡、貧血、高脂血癥、高磷血癥以及長透析齡等危險因素。但傳統(tǒng)危險因素已不能完全解釋MHD

2、患者血管鈣化，因此，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境抑制VSMCs鈣化，堿性環(huán)境促進VSMCs鈣化。然而，間歇性堿刺激對VSMCs鈣化的影響及其可能的機制尚未完全明確，因此本研究將通過模擬MHD患者體內(nèi)特有的pH變化規(guī)律，探討間歇性堿刺激對VSMCs鈣化的影響及可能機制。
　　方法：
　　1.VSMCs的原代培養(yǎng)及實驗分組
　　將血管外膜輕輕剝除，縱行剖開血管，用無菌紗布輕輕擦除內(nèi)膜，應用組織貼壁法進行VSMCs原代培養(yǎng)

3、，并進行鑒定。經(jīng)自然純化后，選取生長良好的4代細胞進行實驗。采用隨機數(shù)字表法，將VSMCs隨機分為6組：正常對照組、高磷+pH7.4組、高磷+pH7.5組、高磷+pH7.6組、高磷+pH7.7組及維拉帕米干預組。干預4 d后，提取各組細胞mRNA和蛋白，進行RNA及蛋白水平檢測，干預14 d后進行鈣化檢測。
　　2.血管環(huán)的培養(yǎng)及實驗分組
　　體外分離大鼠胸主動脈血管環(huán)，采用隨機數(shù)字表法，將VSMCs隨機分為6組：正常對照組

4、、高磷+pH7.4組、高磷+pH7.5組、高磷+pH7.6組、高磷+pH7.7組及維拉帕米干預組。干預14天后，用組織免疫組化方法檢測LTCCβ3、SM22α和Runx2表達情況，并進行鈣化檢測。
　　3.RT-PCR和Western印跡法檢測各目的基因及蛋白的表達
　　細胞干預4天后，分別提取正常對照組、高磷+pH7.4組、高磷+pH7.5組、高磷+pH7.6組、高磷+pH7.7組及維拉帕米干預組mRNA和蛋白，用RT-P

5、CR和Western Blot方法測定L型鈣通道(calcium channels, L-type, LTCC)β3亞基和Runx2的表達情況。
　　4.免疫組化方法檢測血管環(huán)各目的蛋白表達
　　取石蠟切片(3μm)常規(guī)脫蠟，用EDTA高壓鍋煮沸抗原修復，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，滴加一抗：LTCCβ3亞基(1:50)、Runx2(1:100)、SM22α(1:100)，放入4℃過夜；滴加第二代生物素標

6、記的二抗工作液和辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，DAB顯色，顯微鏡下觀察，蒸餾水終止反應，蘇木素復染，明顯棕黃色顆粒為陽性，不著色為陰性。
　　5.VSMCs鈣化情況及ALP活性測定
　　VSMCs鈣含量測定：細胞干預14天，用BCA法測定細胞鈣含量，鈣含量（mg/g）用蛋白含量校準。茜素紅染色：細胞干預14天，加入茜素紅染液，放入37℃溫箱賦育30 min，橘紅色為鈣鹽沉積。ALP活性測定：使用ALP活性試劑盒測定其活性，結果

7、用蛋白含量校準。
　　6.血管環(huán)鈣化情況測定
　　血管環(huán)鈣含量測定：血管環(huán)干預14天后用鄰甲酚酞絡合酮比色法測定鈣含量，以mg/g為單位。硝酸銀鈣化染色：血管環(huán)干預14天后常規(guī)脫蠟、脫水，滴加5%硝酸銀溶液，紫外光照射60 min，5%硫代硫酸鈉溶液定影，堿性品紅復染，鈣鹽沉積處被染為黑褐色。
　　7.VSMCs鈣離子濃度測定
　　細胞干預4天后，使用鈣離子探針技術檢測VSMCs內(nèi)鈣離子濃度。
　　8.統(tǒng)計

8、學處理
　　應用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)應用均數(shù)±標準差表示，多組間均數(shù)差異比較應用單因素方差分析（ANOVA），組間均數(shù)兩兩比較應用SNK檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.間歇性堿刺激對高磷誘導的VSMCs鈣化影響
　　VSMCs茜素紅染色與鈣含量測定結果一致，與正常對照組相比，高磷+pH7.4組鈣鹽沉積增多(P<0.05)；與高磷+pH7.4組相比，高磷+p

9、H7.5組鈣鹽沉積增多(P<0.05)；與高磷+pH7.5組相比，高磷+pH7.6組鈣鹽沉積增多(P<0.05)；與高磷+pH7.6組相比，高磷+pH7.7組鈣鹽沉積增多(P<0.05)；與高磷+pH7.7組相比，維拉帕米干預組鈣鹽沉積減少(P<0.05)。
　　2.間歇性堿刺激對高磷誘導的血管環(huán)鈣化影響
　　血管環(huán)Von Kossa染色與鈣含量測定結果一致，與正常對照組相比，高磷+pH7.4組鈣化結節(jié)增多(P<0.05)；

10、與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.5組鈣化結節(jié)增多(P<0.05)；與高磷+pH7.5組相比，高磷+pH7.6組鈣化結節(jié)增多(P<0.05)；與高磷+pH7.6組相比，高磷+pH7.7組鈣化結節(jié)增多(P<0.05)；與高磷+pH7.7組相比，維拉帕米干預組鈣化結節(jié)減少(P<0.05)。
　　3.間歇性堿刺激對高磷誘導的VSMCs Runx2表達和ALP活性的影響
　　RT-PCR和Western-blot結果均顯示，與

11、正常對照組相比，高磷+pH7.4組Runx2表達水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.5組Runx2表達水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.5組相比，高磷+pH7.6組Runx2表達水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.6組相比，高磷+pH7.7組Runx2表達水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.7組相比，維拉帕米干預組Runx2表達水平降低(P<0.05)。ALP活性測定結果顯示，間歇性堿刺

12、激增加ALP活性(P<0.05)，維拉帕米抑制ALP活性(P<0.05)。
　　4.間歇性堿刺激對高磷誘導的血管環(huán)Runx2和SM22α表達的影響
　　免疫組化結果顯示，與正常對照組相比，高磷+pH7.4組Runx2表達水平增高(P＜0.05)，SM22α表達水平降低(P＜0.05)；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.5組Runx2表達水平增高(P＜0.05)，SM22α表達水平降低(P＜0.05)；與高磷+pH7.5

13、組相比，高磷+pH7.6組Runx2表達水平增高(P＜0.05)，SM22α表達水平降低(P＜0.05)；與高磷+pH7.6組相比，高磷+pH7.7組Runx2表達水平增高(P＜0.05)， SM22α表達水平降低(P＜0.05)；與高磷+pH7.7組相比，維拉帕米干預組Runx2表達水平降低(P＜0.05)，SM22α表達水平增高(P＜0.05)。
　　5.間歇性堿刺激對高磷誘導的VSMCs的LTCCβ3亞基表達及鈣離子內(nèi)流效應

14、的影響
　　RT-PCR和Western-blot結果均顯示，與正常對照組相比，高磷+pH7.4組LTCCβ3亞基表達水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.5組LTCCβ3亞基表達水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.5組相比，高磷+pH7.6組LTCCβ3亞基表達水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.6組相比，高磷+pH7.7組LTCCβ3亞基表達水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.7組

15、相比，維拉帕米干預組LTCCβ3亞基表達水平降低(P<0.05)。熒光顯色結果顯示，間歇性堿刺激增加VSMCs內(nèi)鈣離子熒光強度(P<0.05)，維拉帕米抑制減少VSMCs內(nèi)鈣離子熒光強度(P<0.05)。
　　6.間歇性堿刺激對高磷誘導的血管環(huán)LTCCβ3亞基表達的影響
　　免疫組化結果顯示，與正常對照組相比，高磷+pH7.4組LTCCβ3亞基表達水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.5組LTCC

16、β3亞基表達水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.5組相比，高磷+pH7.6組LTCCβ3亞基表達水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.6組相比，高磷+pH7.7組LTCCβ3亞基表達水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.7組相比，維拉帕米干預組LTCCβ3亞基表達水平降低(P<0.05)。
　　結論：間歇性堿刺激促進高磷誘導的VSMCs的血管鈣化，其機制可能與間歇性堿刺激上調(diào)L型鈣通道β3亞基表達，進而增加鈣離子內(nèi)流