脂代謝相關基因ABHD5在結腸癌發(fā)生發(fā)展及耐藥中的作用及機制研究.pdf

1、背景:
　　結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。結腸癌的發(fā)生、發(fā)展機制不明是目前防治的主要瓶頸，并且由耐藥引起的復發(fā)和轉移是導致結腸癌患者治療失敗及影響預后的重要原因。因此，深入研究促進結腸癌發(fā)生發(fā)展的關鍵分子及調控機制，尋找到逆轉耐藥和化療增敏的新靶點，對降低結腸癌的發(fā)病率，實現個體化精準治療，提高患者生存質量具有十分重要的意義。
　　自

2、噬(Autophagy)又稱為Ⅱ型程序性細胞死亡(TypeⅡ programed cell death)，指細胞通過消化自身某些多余的細胞器，獲得存活所需的營養(yǎng)和能量物質的生物學過程。自噬過程在進化上趨于保守，是各類細胞在應激狀況下氨基酸、核酸等生物大分子物質的主要來源。細胞自噬反應的機體內環(huán)境“動態(tài)平衡”是維護細胞生存穩(wěn)態(tài)的重要保障，與細胞生長、個體發(fā)育及多種疾病發(fā)生密切相關。自噬功能缺陷可導致細胞DNA損傷，增加基因組不穩(wěn)定性，進而

3、觸發(fā)細胞凋亡、老化、周期阻滯、導致腫瘤發(fā)生及藥物抵抗等。在腫瘤的演變過程中，自噬更是具有雙刃劍效應，一方面在腫瘤發(fā)生早期通過防止致癌物質及損傷累積抑制腫瘤發(fā)生，另一方面，在腫瘤形成后通過為腫瘤細胞適應環(huán)境提供能源儲備促進腫瘤進展。目前，已有較多證據表明，有效的調控細胞自噬穩(wěn)態(tài)，是防治腫瘤發(fā)生發(fā)展及促進化療增敏的關鍵，但目前對于腫瘤自噬的調控機制仍不十分清楚。
　　代謝重編程是惡性腫瘤的重要特征，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中伴隨多種代謝相關基

4、因的表達及活性異常。脂代謝相關基因含自水解酶域蛋白5(Abhydrolase domaincontaining5，ABHD5)是體內甘油三酯水解過程中的重要輔酶，其本身雖不具有脂肪酶的活性，但它可通過激活甘油三酯脂肪酶調控脂肪組織和非脂肪組織中的脂肪分解代謝過程。既往有研究表明，該基因在結腸癌中發(fā)揮重要的抑癌作用，但其調控腫瘤發(fā)生的具體機制尚不清楚。已知自噬即參與細胞代謝平衡的調控也在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，但在腫瘤發(fā)生及藥物抵

5、抗過程中代謝相關基因的表達及活性異常是否參與了腫瘤細胞自噬水平的調控尚不明確。我們研究發(fā)現，ABHD5基因缺失可導致的細胞自噬水平降低，推測ABHD5介導的自噬改變是促進結腸癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，并深入進一步探索了ABHD5與Beclin1相互作用調控自噬的分子機制，證實了該基因在結腸癌發(fā)生及5-FU化療耐受中的作用。
　　目的:
　　1、明確ABHD5調控細胞自噬介導結腸癌發(fā)生發(fā)展的作用及分子機制。
　　2、研究AB

6、HD5在結腸癌患者預后和5-FU化療療效評價中的預測價值。
　　材料和方法:
　　1、利用CRISPR/Cas9技術建立ABHD5敲除的CCD841CoN，FHC結腸上皮細胞系，基因敲除技術構建腸道特異性ABHD5敲基因APCmin/+小鼠，結合數據庫分析，彗星實驗，染色質穩(wěn)定性檢測，ABHD5代謝活性位點突變等方法，驗證ABHD5介導細胞自噬改變調控結腸上皮細胞染色質穩(wěn)定性改變及腫瘤發(fā)生的作用。
　　2、利用人結腸上

7、皮細胞CCD841CoN，FHC為模型，結合免疫熒光，CoIP，GST-pulldown等實驗方法，闡明ABHD5與Caspase3競爭自噬關鍵蛋白Beclin1的剪切位點調控細胞自噬水平的分子機制。
　　3、基于慢病毒載體構建ABHD5高低表達的結腸癌細胞系，結合高效液相色譜法，代謝組學分析檢測，核素標記的14C-FU示蹤等方法探索ABHD5調控自噬相關尿嘧啶合成介導5-FU耐藥的作用及機制。
　　4、利用Gene Exp

8、ression Omnibus數據庫中GES29582，GES17536兩個數據集中的全基因表達譜及臨床資料構建發(fā)現集，結合由我院收治的222例結腸癌患者組成的驗證集，分析Ⅱ/Ⅲ期結腸癌ABHD5基因表達與5-FU輔助化療療效的關系。
　　結果:
　　1、ABHD5缺失導致正常結腸上皮細胞和腺瘤細胞自噬水平顯著降低、DNA修復能力減弱、基因組不穩(wěn)定性明顯增強，促進腫瘤發(fā)生;在腸道特異性敲除ABHD5的APCmin/+腸道腺瘤

9、小鼠模型中，ABHD5缺失可通過抑制細胞自噬反應促進腺瘤癌變。
　　2、ABHD5可與Caspase3競爭自噬關鍵蛋白Beclin1的ASP124，ASP133，ASP149三個剪切位點，并以此調控Beclin1的剪切活性介導細胞自噬水平改變。結腸上皮細胞由于ABHD5基因缺失，促進Caspase3與Beclin1的結合，上調Beclin1剪切活性，導致Beclin1被剪切為N端片段與C端片段，失去誘導細胞自噬的能力，促進腫瘤發(fā)生

10、。利用Beclin1的特異性激動劑上調Beclin1誘導細胞自噬的活性，可在小鼠體內回復ABHD5缺失后的促腫瘤發(fā)生效應。
　　3、ABHD5基因缺失導致細胞自噬相關尿嘧啶補救合成途徑受損，內源性嘧啶合成減少，當給予5-FU處理時，細胞誤將5-氟尿嘧啶作為DNA合成底物大量攝取進入細胞，上調結腸癌細胞對5-FU的藥物敏感性，促進細胞死亡。
　　4、人結腸癌組織中ABHD5表達與Ⅱ/Ⅲ期結腸癌患者5-FU輔助化療療效具有相關性

11、。ABHD5缺失的患者預后較差，但該類患者可從5-FU輔助化療中獲益，而ABHD5高表達的患者其本身預后較好，經5-FU輔助化療后DFS卻明顯縮短。
　　結論:
　　1、ABHD5缺失導致正常結腸上皮細胞和腺瘤細胞自噬水平顯著降低、DNA修復能力減弱、染色體不穩(wěn)定性顯著增強，促進結腸癌發(fā)生。
　　2、ABHD5可競爭性結合Beclin1的Caspase3剪切位點，通過非PNPLA2依賴的代謝途徑調控Beclin1介導的