慢病毒載體介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞抑制視網(wǎng)膜新生血管的研究.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 細胞實驗——重組慢病毒LV-Endostatin-GFP載體的建立及體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞
　　目的：
　　內(nèi)皮抑素(Endostatin，ES)是作用最強的抑制血管生長的因子之一，不影響正常組織周圍的血管，而且無毒性和耐藥性，增加內(nèi)源性ES的表達可能成為抑制視網(wǎng)膜新生血管化的一種治療措施。而同時基于移植健康的EPC已成為了治療視網(wǎng)膜新生血管疾病的新途徑，本研究旨在體外實驗構(gòu)建E

2、S高表達內(nèi)皮祖細胞株，檢測ES高表達對VEGF表達的影響和EPC細胞功能的影響，為動物實驗做準備。
　　方法：
　　大鼠心臟采血，用密度梯度離心法獲取單個核細胞，并將細胞接種于纖維蛋白包被過的培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)于內(nèi)皮祖細胞專用培養(yǎng)基(EGM-2-MV)中。分別利用流式細胞術(shù)及免疫熒光法鑒定內(nèi)皮祖細胞。
　　用PCR方法得到Endostatin序列片段，將Endostatin基因插入含綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒載體質(zhì)

3、粒（LV5-EF1 a-GFP+PURO），通過三個輔助質(zhì)粒（pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5），采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法共轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293T細胞，獲得重組慢病毒(LV-Endostatin-GFP)，感染大鼠EPC，使得基因整合入EPC中并持續(xù)表達，然后采用最佳篩選濃度的嘌呤霉素溶液進行篩選，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Endostatin基因的E

4、PC細胞株。
　　通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）驗證Endostatin在EPC細胞的表達。同時測定Endostatin轉(zhuǎn)染對于VEGF表達的變化。檢測內(nèi)皮祖細胞轉(zhuǎn)染前后的細胞活性（增殖能力、遷移率、分化能力、凋亡和細胞周期）。
　　結(jié)果：
　　構(gòu)建重組慢病毒載體（L

5、V-Endostatin-GFP），轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞后，利用最佳篩選濃度的嘌呤霉素（1μg/ml，4天），成功構(gòu)建攜帶內(nèi)皮抑素基因的內(nèi)皮祖細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株。qRT-PCR和Western blot試驗顯示Endostatin在EPC細胞中表達明顯增高(P＜0.001)，但VEGF的表達水平明顯下降（P＜0.05）。
　　內(nèi)皮祖細胞轉(zhuǎn)染前后細胞的活性檢測發(fā)現(xiàn)Endostatin高表達可抑制細胞活性，與陰性對照組相比，Endostatin高表

6、達內(nèi)皮祖細胞增殖率明顯下降(P＜0.001)，遷移率明顯下降(P＜0.01)和分化能力明顯下降(P＜0.001)，凋亡率明顯增高(P＜0.001);流式細胞儀檢測Endostatin高表達后細胞分裂停留在G1期明顯增多(P＜0.001)，而S和G2期細胞則顯著減少(P＜0.001)，細胞生長明顯受到抑制。而陰性對照組細胞活性未見明顯影響。
　　結(jié)論
　　EPC細胞可以被攜帶內(nèi)皮抑素基因的慢病毒載體(LV-Endostatin

7、-GFP)轉(zhuǎn)染并高表達內(nèi)皮抑素，VEGF的分泌顯著減少，同時Endostatin高表達可促使EPC凋亡，降低EPC的增殖、遷移及分化能力，細胞生長受到抑制，從而降低細胞活性。而陰性對照組細胞活性沒有受到影響，說明轉(zhuǎn)染過程本身沒有對細胞的活性造成影響。轉(zhuǎn)染了內(nèi)皮抑素基因的EPC細胞可能通過分泌內(nèi)皮抑素發(fā)揮細胞內(nèi)的直接及旁分泌作用（抑制VEGF的分泌），從而抑制血管生成的作用。但體外實驗結(jié)果須動物實驗加以驗證。
　　第二部分 動物實驗

8、——玻璃體腔注射攜帶Endostatin基因EPC抑制大鼠視網(wǎng)膜新生血管生成的實驗研究
　　目的：
　　本研究以慢病毒-內(nèi)皮抑素(LV-ES)體外轉(zhuǎn)染外周血EPC后的細胞(ES-EPCs)移植入大鼠視網(wǎng)膜新生血管模型，探討EPC導(dǎo)向的內(nèi)皮抑素基因抑制視網(wǎng)膜新生血管生成的可行性和有效性，為抑制視網(wǎng)膜新生血管疾病血管生成的基因治療提供依據(jù)。
　　方法：
　　新生7d(P7)的SD大鼠分為兩大組:一組暴露于70％高氧環(huán)

9、境5天，另一組為正常環(huán)境空白對照。分別于鼠齡P14，P15，P17，P19時用眼底血管造影(FFA)觀察視網(wǎng)膜新生血管形成，確定氧誘導(dǎo)的的視網(wǎng)膜病變(OIR)模型的構(gòu)建。
　　又將模型大鼠隨機分為四組，于出生后第14天(P14)四組大鼠經(jīng)玻璃體腔注入相同體積的質(zhì)?；蚣毎ǚ謩e為空載LV，LV-ES，EPC以及LV-ES-EPC）。并設(shè)置同齡幼鼠置空白對照組。每組選3只大鼠，于注射后第1h、1d、3d、5d進行活體FFA的檢測，比較

10、各組新生血管的滲漏面積（于檢測當日注射熒光素鈉），于注射后5d進行活體FFA檢測后處死，取右眼進行組織切片，利用蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin，HE)染色法，觀察并計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細胞核數(shù)。并通過免疫組化方法(ICC)檢測視網(wǎng)膜新生血管組織的Endostatin、VEGF、CD31及CD133的表達。
　　結(jié)果：
　　FFA檢查發(fā)現(xiàn)，實驗組熒光素明顯滲漏，對照組未見熒光滲漏，說明

11、視網(wǎng)膜新生血管形成，OIR模型成功建立.
　　FFA結(jié)果顯示:
　　注射LV-ES(OIR+ES OE)組:與空白對照組比，熒光滲漏每個時間點都沒有顯著性差異，說明新生血管被顯著抑制;與NC組（注射空載LV）比，熒光滲漏在第3天(P＜0.01)和第5天(P＜0.001)顯著減少，說明OIR+ES OE組顯著抑制新生血管。
　　注射EPC(OIR+EPCs)組:與空白對照比，每個時間點，熒光滲漏增加(P＜0.05);與N

12、C比，每個時間點沒有統(tǒng)計學(xué)差異;與OIR+ES OE組比，1天(P＜0.05)，3天(P＜0.01)，5天(P＜0.001)熒光滲漏均增加，說明OIR+EPCs組確實沒有抑制新生血管的作用，但不會促進血管滲漏及新生血管形成。
　　注射LV-ES-EPC(OIR+ES-EPCs)組:與空白對照組比，每個時間點熒光滲漏都沒有顯著性差異，說明新生血管被顯著抑制;與NC比，第5天時熒光滲漏顯著減少(P＜0.001);與OIR+ES OE組

13、比，每個時間點熒光滲漏均無顯著性差異，說明OIR+EPCs組有與OIR+ES OE一樣的抑制新生血管的作用;與OIR+EPCs組比，1天(P＜0.05)，3天(P＜0.01)，5天(P＜0.001)熒光滲漏均顯著減少，說明OIR+ES-EPCs組有明顯抑制新生血管的作用。
　　HE結(jié)果:空白對照組，視網(wǎng)膜新生血管較少;與空白對照組比，OIR+NC和OIR+EPCs組血管內(nèi)皮細胞核明顯增多(P＜0.01)，說明新生血管顯著增多;與N

14、C比，OIR+ES-OE和OIR+ES-EPCs組血管內(nèi)皮細胞核顯著減少(P＜0.05)，說明新生血管顯著減少;與OIR+ES OE組比，OIR+EPCs組血管內(nèi)皮細胞核明顯增多(P＜0.05)，說明新生血管顯著減少;與OIR+EPCs組比，OIR+ES-EPCs組血管內(nèi)皮細胞核明顯減少(P＜0.01)，說明新生血管顯著減少。
　　ICC結(jié)果顯示:
　　Endostatin的表達情況:與空白對照組比，OIR+NC組表達減少(

15、P＜0.05);與NC比，OIR+ES-OE和OIR+ES-EPCs組表達增多(P＜0.01);與OIR+ES OE組比，OIR+EPCs組表達減少(P＜0.05);與OIR+EPCs組比，OIR+ES-EPCs組表達增多(P＜0.05)。
　　VEGF的表達情況:與空白對照組比，OIR+NC組表達增多(P＜0.05);與NC比，OIR+ES-OE，OIR+EPCs和OIR+ES-EPCs組表達沒有顯著差異;OIR+ES-OE，O

16、IR+EPCs和OIR+ES-EPCs三組也沒有顯著性差異。
　　CD31的表達情況:與空白對照組比，OIR+NC和OIR+EPCs組表達增多(P＜0.05);與NC比，OIR+ES-OE組表達減少(P＜0.05);與OIR+ES-OE組比，OIR+EPCs組表達顯著增多(P＜0.05);但和OIR+EPCs組比，OIR+ES-EPCs組表達沒有顯著差異。
　　CD133的表達情況:與空白對照組比，OIR+NC，OIR+EP

17、Cs組和OIR+ES-EPCs組表達減少(P＜0.05);與NC比，OIR+ES-OE組表達增加(P＜0.05);與OIR+ES-OE組比，OIR+EPCs和OIR+ES-EPCs組表達顯著減少(P＜0.05);但和OIR+EPCs組比，OIR+ES-EPCs組表達沒有顯著差異。
　　結(jié)論：
　　FFA法，HE染色和ICC法的聯(lián)合研究證實，Endostatin基因轉(zhuǎn)染的EPC可明顯抑制視網(wǎng)膜新生血管生成，單純的EPC不會促進