人乳鐵蛋白表達載體的構建及轉基因陽性細胞株的建立.pdf

1、人乳鐵蛋白（Human Lactoferrin，hLF）是一種具有高級空間結構的糖蛋白，具有廣泛的生物學作用。大量體內體外試驗表明：hLF不僅在腸道鐵離子的吸收以及抵抗細菌、病毒、真菌、單細胞生物等方面具有重要作用，而且在調節(jié)炎癥反應、調控基因表達及促進骨骼生長方面也具有重要作用。因此，hLF在疾病防治、營養(yǎng)補充、食物或藥品的貯藏等方面具有廣闊的應用前景，已成為近幾年來研究的熱點之一，利用原核和真核表達系統(tǒng)已在生產重組hLF方面做了很多

2、嘗試.然而，還有很多問題尚待解決，如蛋白的表達水平較低、翻譯后的蛋白缺乏準確的修飾及純化步驟復雜等，均致使這些方法不適合大規(guī)模的生產重組hLF。通過乳腺生產外源蛋白，具有成本低、分離純化簡單、可持續(xù)生產、不易污染及所表達的外源蛋白可進行翻譯后加工、具有d然蛋白的結構與活性等優(yōu)點，是生產基因工程藥物的理想場所。
　　 鑒于此，本研究構建了hLF cDNA基因乳腺表達載體pGBC-hLF，此載體為隨機插入載體。為進行載體的體外表達驗

3、證，在此載體中引入了Neo篩選基因，并在山羊乳腺上皮細胞和小鼠乳腺上皮細胞中進行表達驗證，為下一步制備穩(wěn)定整合有人乳鐵蛋白cDNA基因的山羊胎兒成纖維細胞提供試驗支撐；為了制備轉hLF cDNA基因的山羊胎兒成纖維細胞并提高轉基因細胞的篩選效率，本研究在pGBC-hLF基礎上引入了新霉素基因（Neo）和增強綠色熒光蛋白（EGFP）基因作為篩選標記，并利用條件培養(yǎng)液培養(yǎng)轉基因細胞，試驗發(fā)現(xiàn)這樣可有效縮短G418藥物作用時間，并可得到較純的

4、轉基因細胞；為了下一步獲得在基因組中定點整合有hLF cDNA基因的轉基因奶山羊，消除位置效應對目的基因的表達影響，本試驗又構建了人乳鐵蛋白的打靶載體pGBC5-hLF，并在山羊乳腺上皮細胞中進行了載體的生物活性分析，為下一步實驗室制備hLF cDNA基因在山羊β-casein基因座定位整合的胎兒成纖維細胞奠定基礎。
　　 本試驗的具體內容如下：
　　 （1）構建了人乳鐵蛋白（hLF）基因的乳腺表達載體pGBC-hLF，

5、F-Neo并驗證其在乳腺細胞中的表達情況。本載體以山羊β-casein基因上游包括啟動子、外顯子1、內含子1、部分外顯子2作為5'端調控序列，下游包括部分外顯子7、內含子7、外顯子8、內含子8、外顯子9及3'部分基因組片段作為3'端調控序列，長度分別為6.2 kb和7.1 kb，將hLF基因（目的基因）和Neo基因（篩選標記）分別插入到5'端調控序列和3'端調控序列的下游，構建成pGBC-hLF-Neo載體，其全長為25.348 kb。

6、'為了檢測該載體的生物學功能，本試驗進一步用脂質體介導法將其分別導入到山羊乳腺上皮細胞GMC和小鼠乳腺上皮細胞株C127中進行表達驗證，經G418抗性篩選8-10 d，得到的抗性細胞克隆經催乳素、胰島素及氫化可的松誘導培養(yǎng)，通過RT-PCR和WesternBlot檢測表明，本研究所構建的hLF基因乳腺表達載體具有生物學活性，山羊β-casein基因啟動子驅動的hLF基因能夠在C127和GMC等乳腺上皮細胞中轉錄翻譯，這為下一步建立穩(wěn)定整

7、合hLF基因奶山羊胎兒成纖維細胞奠定了基礎。
　　 （2）構建了帶有雙標記基因Neo和EGFP的乳腺表達載體pGBC-hLF-Neo-IRES2-EGFP，并通過酶切、PCR、測序鑒定了所構建載體的完整性。通過脂質體轉染山羊胎兒成纖維細胞，經G418抗性篩選7-10d后得到綠色熒光細胞克?。焕脝蝹€或多個表達綠色熒光蛋白的轉基因細胞分離培養(yǎng)了轉基因細胞，并通過試驗對比條件培養(yǎng)液和非條件培養(yǎng)液對轉基因細胞克隆形成效率的影響，結果證

8、明條件培養(yǎng)液更有利于陽性細胞克隆的形成。借助EGFP和Neo基因作為雙篩選標記，可有效的縮短轉基因細胞在G418藥物中的培養(yǎng)時間，提高了陽性克隆細胞的篩選效率。嘗試了利用多重PCR鑒定了表達載體在轉基因細胞基因組中的整合情況，避免了單基因PCR導致的假陽性問題；建立了轉hLF基因山羊胎兒成纖維細胞，為以后核移植技術生產轉基因克隆動物所需的供體細胞的制備提供了一種參考體系。
　　 （3）構建了人乳鐵蛋白基因的β-casein基因座

9、的定點打靶載體，此載體以β-casein上游包括啟動子，外顯子1、內含子1及部分外顯子2的6.3kb的調控序列作為5'同源長臂，以下游2.4 kb的序列包括外顯子8和9作為3'同源短臂，Neo基因和tk基因分別作為正負篩選基因，并在Neo基因兩端分別加上正向重復序列l(wèi)oxp序列；將人乳鐵蛋白基因（hLF）克隆到5'同源長臂下游，Neo克隆到β-casein基因7、8外顯子之間，tk基因克隆到3'同源短臂外側并用原核序列進行保護；經克隆重