ATM對乳腺癌細胞遷移和侵襲影響及其機制研究.pdf

1、目的：
　　探討ATM對乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響及其調(diào)控機制。
　　方法：
　?。?）利用免疫組織化學方法檢測乳腺癌癌旁腫瘤組織（以下簡稱正常乳腺組織）、侵潤、侵潤伴轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中p-ATM蛋白的表達；乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞分別經(jīng)常氧（21% O2）和低氧（1%O2）處理后，細胞免疫熒光和Western Blot檢測p-ATM和總ATM表達，Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力.

2、　　（2）利用shRNA技術(shù)和ATM特異性抑制劑Ku60019抑制乳腺癌BT549和MDA-MB-231細胞中ATM功能，Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。
　　（3）BT549細胞Ku60019處理組和溶劑對照組做磷酸化蛋白質(zhì)組學分析，利用DAVID軟件對靶蛋白進行GO和KEGG信號通路富集分析，篩選與遷移和侵襲相關(guān)的靶蛋白。
　?。?）利用IP實驗驗證靶基因與ATM相互作用并受其調(diào)控，采用shRNA技術(shù)敲低靶

3、蛋白，Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。
　?。?）利用定點突變技術(shù)，Transwell實驗，IP實驗，細胞應力纖維染色技術(shù)驗證靶蛋白特異性磷酸化位點功能。
　　結(jié)果：
　?。?）隨著乳腺腫瘤分級的增加，p-ATM蛋白的表達逐漸增強；與常氧組相比，低氧處理后p-ATM表達量顯著增加，細胞遷移和侵襲能力顯著增強。
　?。?）ATM敲低或抑制后，細胞遷移和侵襲能力顯著下調(diào)。
　?。?）磷酸化蛋白質(zhì)組

4、學分析結(jié)果顯示，ATM下游靶蛋白主要參與細胞間粘附過程，調(diào)控肌動蛋白細胞骨架等信號通路。結(jié)合文獻和質(zhì)譜數(shù)據(jù)選擇與遷移侵襲相關(guān)的靶蛋白為CTTN，其特異性磷酸位點為S113。
　?。?）IP實驗證實ATM可以磷酸化CTTN S113位點，敲低CTTN的表達，乳腺癌細胞遷移和侵襲能力顯著下調(diào)。
　?。?）利用定點突變實驗發(fā)現(xiàn)，CTTN S113位點磷酸化可以促進癌細胞遷移和侵襲。進一步通過IP實驗和細胞應力纖維染色實驗發(fā)現(xiàn)CTT