基于微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的新型超敏外周血HBV-DNA檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用.pdf

1、目的：基于微滴式數(shù)字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技術(shù)，建立一種新型超敏的外周血乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA檢測(cè)方法。評(píng)價(jià)其特異性與敏感性，并進(jìn)一步探討其在慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）患者長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)和治療過(guò)程中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1、將載有HBV-DNA的質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?/p>

2、用ddPCR檢測(cè)各濃度梯度的HBV-DNA,來(lái)評(píng)價(jià)ddPCR的準(zhǔn)確性和敏感性。
　　2、收集慢性乙型肝炎患者的外周血，利用ddPCR和目前臨床常規(guī)使用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法對(duì)比檢測(cè)，評(píng)價(jià)其與qRT-PCR相比的優(yōu)缺點(diǎn)。
　　3、將多個(gè)濃度梯度的 HBV-DNA質(zhì)控品血清，利用QIAamp UltraSens

3、Virus Kit高度濃縮提取后，再進(jìn)行ddPCR的檢測(cè)。通過(guò)HBV-DNA質(zhì)控品血清的模擬檢測(cè)，評(píng)價(jià)血清經(jīng)QIAamp UltraSens Virus Kit高度濃縮提取后的ddPCR檢測(cè)方法在各濃度梯度檢測(cè)的敏感性和準(zhǔn)確性，以及其重復(fù)測(cè)量的穩(wěn)定性。
　　4、將血清/血漿內(nèi)的HBV-DNA高度濃縮后的ddPCR檢測(cè)方法對(duì)臨床上抗病毒治療后外周血HBV-DNA低于檢測(cè)下限的CHB患者進(jìn)行隨訪檢查，評(píng)價(jià)其實(shí)際應(yīng)用的意義與價(jià)值。

4、>　　結(jié)果：
　　1、通過(guò)ddPCR檢測(cè)各濃度梯度的HBV-DNA質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)ddPCR有較高的敏感性，可檢測(cè)出單個(gè)拷貝的加入量。并且在各濃度的檢測(cè)與理論值有高度的可重復(fù)性和相關(guān)性（r=0.997，P=0.000）。在Bland-Altman分析中，可以見(jiàn)到ddPCR在各濃度的檢測(cè)與理論值相比呈現(xiàn)較高的準(zhǔn)確性和一致性，但當(dāng)加入量為單拷貝或大于105時(shí)，其變異性較大。
　　2、在檢測(cè)臨床標(biāo)本時(shí)，ddPCR和qRT-PCR的檢測(cè)結(jié)

5、果存在較高的一致性與相關(guān)性（r=0.931，P=0.000）。但在對(duì)低病毒載量樣本的檢測(cè)，ddPCR似乎呈現(xiàn)較高的敏感性。
　　3、在質(zhì)控品的檢測(cè)試驗(yàn)中，QIAamp UltraSens Virus Kit高度濃縮后ddPCR檢測(cè)結(jié)果與質(zhì)控的理論值表現(xiàn)有良好的相關(guān)性（r=0.993，P=0.000）和一致性。對(duì)濃度為0.93log10 IU/mL的質(zhì)控品檢測(cè)中，可達(dá)到50％的檢出率。其他濃度梯度的質(zhì)控品的檢測(cè)，檢出率為100%。各

6、濃度梯度質(zhì)控品的重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果呈現(xiàn)良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，未出現(xiàn)失控的表現(xiàn)。
　　4、利用高度濃縮后ddPCR的檢測(cè)方法，對(duì)臨床經(jīng)抗病毒治療轉(zhuǎn)陰的患者隨訪。我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論HBeAg陽(yáng)性或陰性組的病人中都會(huì)出現(xiàn)一部分病人存在或短或長(zhǎng)的血清低病毒載量的狀態(tài)，以及出現(xiàn)少數(shù)轉(zhuǎn)陰后的低病毒載量的病毒突破，然而臨床上常規(guī)的病毒學(xué)檢測(cè)卻未能發(fā)現(xiàn)這些。
　　結(jié)論：
　　1、ddPCR對(duì)HBV-DNA的檢測(cè)呈現(xiàn)良好的準(zhǔn)確性和敏感性。