高鹽環(huán)境對LPS刺激后RPE細胞炎性反應的影響及其機制的探討.pdf

1、背景：視網(wǎng)膜色素上皮（RPE），位于視網(wǎng)膜外層，與脈絡膜相連，由緊密連接的單層細胞構成，具有支持和營養(yǎng)觀感受器細胞、遮光、散熱以及再生和修復作用。由RPE自發(fā)產(chǎn)生的細胞系ARPE-19，在過去數(shù)十年已經(jīng)被廣泛應用于對RPE病理生理的研究，包括老年性黃斑病變（AMD）、玻璃體視網(wǎng)膜病變、葡萄膜炎等多種疾病。受各種外界刺激后，ARPE-19細胞分泌的最主要細胞因子是白介素6（IL-6）、白介素（IL-8）和單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）。

2、IL-6被廣泛認為是一種促炎細胞因子，在眼內(nèi)免疫應答和炎癥反應中起到重要作用；IL-8和MCP-1是中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞的重要化學趨化因子，在炎癥性視網(wǎng)膜疾病時它們能夠使這些細胞遷移浸潤于眼內(nèi)的組織中。
　　據(jù)文獻報道，基因和環(huán)境因素都參與了眼內(nèi)炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展。導致眼部疾病的環(huán)境因素的關注重點主要是感染在自身免疫是性葡萄膜炎發(fā)病和發(fā)展的作用，而對于日常飲食因素的研究相對較少。目前研究證據(jù)表明，高鹽飲食可能參與了自

3、身免疫性疾病的病理改變。最近的研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食能夠通過誘導Th17細胞的免疫應答來加劇小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的嚴重程度。而高鹽環(huán)境對Th17細胞的作用是通過活化了p38/MAPK細胞通路及其細胞核內(nèi)的途徑NFAT5、SGK1。病例對照研究表明高鹽飲食的攝入會增加吸煙人群罹患風濕性關節(jié)炎的風險，并且高鹽攝入與多發(fā)性硬化病人在臨床醫(yī)學上和放射醫(yī)學上的疾病活動性增加有密切聯(lián)系。高鹽的攝入是否能夠影響葡萄膜炎等眼部自身免疫疾病

4、目前尚不清楚。
　　由于視網(wǎng)膜色素上皮層作為細胞調(diào)節(jié)介質(zhì)在眼內(nèi)炎癥反應中具有重要作用，本課題主要探討高鹽環(huán)境對視網(wǎng)膜色素上皮層細胞細胞因子釋放的影響及其活化的細胞信號傳導通路。
　　目的：高鹽環(huán)境已經(jīng)被證實能夠通過誘導活化病理性Th17細胞來加劇自身免疫疾病的病理改變，但在眼部炎癥性疾病尤其是葡萄膜炎等眼部自身免疫性疾病中的影響尚不清楚。本課題探討高鹽環(huán)境對 ARPE-19細胞產(chǎn)生炎性細胞因子的影響以及可能參與這一反應的機制

5、。
　　方法：ARPE-19細胞在含有10％血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中生長至成熟融合后用脂多糖（LPS）刺激，并分別加入氯化鈉20mM和40mM。通過流式細胞術檢測高鹽對細胞凋亡的影響；通過細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8），檢測細胞增值的變化；通過酶聯(lián)免疫定量吸附實驗（ELISA）檢測DMEM培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-8和MCP-1炎性細胞因子的含量；采用流式細胞術和熒光定量PCR技術檢測可能參與高炎所致炎性反應的細胞信號通路。

6、
　　結果：
　?。?）LPS刺激后的RPE細胞，加入20mM和40mM氯化鈉培養(yǎng),Annexin/PI染色并用流式技術檢測，與空白對照組相比，兩種濃度均不能引起細胞凋亡的顯著變化。
　?。?）LPS刺激后的RPE細胞，加入20mM和40mM氯化鈉培養(yǎng)。與空白對照組比較，細胞在刺激24h、48h和72h后的增殖狀態(tài)沒有明顯的差異。
　?。?）LPS刺激后的RPE細胞，加入20mM和40mM氯化鈉培養(yǎng)24h，收集上

7、清培養(yǎng)液，ELISA檢測其中的細胞因子結果表明：40mM濃度的氯化鈉可對細胞IL-6和MCP-1的分泌有明顯促進作用，而IL-8沒有顯著變化；20mM氯化鈉僅能使MCP-1的分泌量增加，而對IL-6和IL-8均沒有顯著影響。
　?。?）LPS刺激后的RPE細胞，加入80mM甘露醇和40mM氯化鈉培養(yǎng)24h。檢測上清培養(yǎng)液中的細胞因子，結果表明甘露醇不能引起IL-6、IL-8和MCP-1分泌的明顯變化，而40mM氯化鈉依舊對IL-6

8、和MCP-1的分泌有顯著的上調(diào)作用，從而排除單純滲透壓對細胞炎性反應的影響。
　　（5）LPS刺激后的RPE細胞，與20mM和40mM氯化鈉共培養(yǎng)后，收集細胞，流式細胞術上機檢測細胞通路的磷酸化水平。40mM濃度使p38/MAPK、Akt和NF-κB的磷酸化水平顯著升高，而對JNK和ERK-1/2的磷酸化水平?jīng)]有統(tǒng)計學影響；20mM濃度對各細胞通路均不能使其磷酸化水平發(fā)生明顯變化。
　?。?）檢測p38/MAPK下游的核內(nèi)細