人參皂苷Rd對成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細胞神經(jīng)發(fā)生的影響及機制研究.pdf

1、長期以來，神經(jīng)病學領域都認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟的神經(jīng)元屬于終末分化細胞，很難再進行分裂和增殖。因而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、變性導致的神經(jīng)元丟失及神經(jīng)元的損傷難以得到自我修復，神經(jīng)功能的重建被視為不可能?？茖W家們對體外神經(jīng)干細胞（NSCs）分離培養(yǎng)和增殖的成功，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生和功能重建帶來了新的希望。但目前已有的促進 NSCs增殖和分化的方法都因其臨床治療可操作性不強而制約了臨床轉化應用。因此找到一種促進 NSCs增殖和定向分化的藥物可能

2、為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療提供新的可行途徑。人參皂苷 Rd（GSRd）是從人參和三七中提取的一種單體化合物，是它們主要活性成分之一。我們前期的臨床和基礎研究發(fā)現(xiàn)，GSRd具有明確的神經(jīng)保護作用：治療腦梗死安全有效、減少腦缺血模型大鼠梗死體積、減少神經(jīng)元死亡、促進大鼠運動功能恢復等。但 GSRd是否能促進成年哺乳動物腦內(nèi) NSCs的神經(jīng)發(fā)生從而發(fā)揮神經(jīng)修復功能呢？目前還鮮有報道。為此本研究擬在在體和離體探究 GSRd對 NSCs增殖及分化的

3、作用并初步探索可能的分子機制。
　　第一部分GSRd對成年大鼠腦內(nèi)海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生影響的研究
　　目的：探究 GSRd對海馬齒狀回 NSCs增殖分化的影響。
　　方法：（1）30 mg/kg的GSRd腹腔注射到成年大鼠體內(nèi)，每天注射1次，連續(xù)注射1周。GSRd給藥后的第7 d和第14 d處死大鼠，將海馬區(qū)切片，通過 BrdU染色、DCX染色，觀察GSRd對海馬區(qū) NSCs增殖和新生神經(jīng)元的影響。（2）GSRd給藥后的

4、第34 d處死大鼠，將海馬區(qū)切片，進行 BrdU/NeuN和 BrdU/GFAP熒光雙標記染色，觀察 GSRd對海馬區(qū) NSCs分化的影響。
　　結果：（1）GSRd干預后7 d，GSRd組的海馬齒狀回BrdU和 DCX陽性細胞數(shù)明顯增加（P＜0.05）；GSRd干預后14 d，GSRd組海馬區(qū) BrdU和 DCX陽性細胞的數(shù)目與對照組相比無明顯差異。（2）GSRd組的BrdU+/NeuN+雙標記細胞與對照組相比，數(shù)量明顯增加（

5、P＜0.05）。但兩組BrdU+/NeuN+雙標記細胞占總 BrdU+細胞百分數(shù)無統(tǒng)計學差異。另外，對 GSRd組和對照組進行 BrdU/GFAP免疫熒光雙標記染色，兩組均沒有觀察到 BrdU+/GFAP+雙標記細胞。
　　結論：GSRd顯著增加海馬齒狀回 NSCs及新生神經(jīng)元的數(shù)量，但對NSCs的分化并無明顯作用。
　　第二部分GSRd對培養(yǎng) NSCs增殖分化影響的研究
　　目的：探究 GSRd對體外培養(yǎng) NSCs增

6、殖分化的影響。
　　方法：（1）分離培養(yǎng)胎鼠 NSCs并進行神經(jīng)球鑒定和分化鑒定。（2）體外培養(yǎng) NSCs，經(jīng)過不同濃度 GSRd干預后，觀察神經(jīng)球的數(shù)量和大小的變化；CCK-8法、BrdU免疫熒光染色分別觀察GSRd對 NSCs存活和增殖的影響。（3）體外培養(yǎng) NSCs，經(jīng)過 GSRd干預后，分別進行 Tuj-1、GFAP和 CNPase免疫熒光染色，觀察 GSRd對 NSCs分化的影響。
　　結果：（1）對體外培養(yǎng)的NS

7、Cs進行 Nestin、Ki67免疫細胞化學染色，結果顯示被染色的細胞呈 Nestin陽性和 Ki67陽性反應。Tuj-1、GFAP、CNPase免疫細胞化學染色結果顯示，所培養(yǎng)的NSCs可以定向分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞以及少突膠質(zhì)細胞，具有多向分化的潛能。（2）與對照組相比，GSRd組神經(jīng)球的數(shù)目和直徑明顯增加（P＜0.05）；CCK-8法、BrdU免疫熒光染色結果顯示，GSRd可明顯促進體外培養(yǎng)的NSCs的存活和增殖（P＜0.05

8、）。（3）體外培養(yǎng)的NSCs，GSRd處理組 Tuj-1、GFAP和 CNPase陽性細胞百分率與對照組相比無明顯差異。
　　結論：GSRd可促進體外培養(yǎng) NSCs存活和增殖，對體外培養(yǎng) NSCs的分化無影響。
　　第三部分GSRd促進神經(jīng)干細胞神經(jīng)發(fā)生機制的研究
　　目的：探究 GSRd促進神經(jīng)干細胞神經(jīng)發(fā)生可能的分子機制。
　　方法：（1）Western Blot測定 GSRd干預后的NSCs中 Akt、p-

9、Akt、ERK、p-ERK、PKC、p-PKC蛋白表達水平；（2） Western Blot測定 PI3K/Akt信號通路抑制劑 LY294002、MAPK/ERK1/2信號通路抑制劑 PD98059干預下經(jīng) GSRd作用的NSCs中 Akt、p-Akt、ERK、p-ERK蛋白表達；（3） CCK-8法、BrdU免疫熒光染色分別觀察LY294002和 PD98059干預下經(jīng) GSRd作用的NSCs的存活和增殖。
　　結果：（1）與

10、對照組相比，GSRd組 p-Akt、p-ERK蛋白表達明顯增加（P＜0.05），但 Akt、ERK、PKC、p-PKC蛋白表達與對照組相比無明顯差異。（2）與 GSRd組相比， LY294002干預組和 PD98059干預組 p-Akt、p-ERK蛋白表達降低（P＜0.05）。（3）LY294002和 PD98059可明顯減弱 GSRd干預的NSCs的存活和增殖（P＜0.05）。
　　結論：GSRd可能通過 PI3K/Akt和 M