PI3K-Akt-mTOR通路在鎘致BRL3A細胞自噬中的作用.pdf

1、自噬是應激介導的溶酶體參與分解細胞內細胞器和長壽命蛋白質的過程，其與機體正常發(fā)育、衰老、延長壽命、免疫和防御微生物侵襲等過程有關。應激條件下，自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)和能量平衡的重要過程。鎘(Cd)是一種重要的環(huán)境和職業(yè)污染物，可引起多種器官損傷，其中肝臟是重要的靶器官。研究表明，鎘可引起多種細胞自噬水平上升，但具體的作用機制尚不是十分清楚。本試驗以大鼠肝細胞系(BRL3A)為研究模型，探究鎘對BRL3A細胞自噬水平的影響;自噬在鎘致BRL3

2、A細胞損傷中的作用;以及PI3K/Akt/mTOR通路在鎘致BRL3A細胞自噬中的作用，從而為進一步闡明鎘致肝臟毒性機理提供理論依據。
　　1.鎘對BRL3A細胞自噬的影響
　　為了探究鎘對BRL3A細胞自噬水平的影響，采用不同濃度的醋酸鎘(0、2、4、8、16μmol/L)處理細胞4h，免疫印跡法檢測自噬體標志性蛋白LC3表達。8μmol/L鎘處理細胞4h后，免疫熒光法觀察LC3聚點現(xiàn)象，單丹磺酰尸胺(MDC)染色觀察晚期

3、自噬溶酶體。結果表明，與對照組相比，隨著鎘濃度的升高，細胞內LC3-Ⅱ含量先上升后下降，8μmol/L時，LC3-Ⅱ含量最高，差異顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）;免疫熒光與MDC染色結果都表明鎘可以引起細胞自噬溶酶體數(shù)量明顯增多。以上結果說明鎘可以引起B(yǎng)RL3A細胞自噬水平上升。
　　2.自噬在鎘致BRL3A細胞損傷中的作用
　　為了探究自噬在鎘致BRL3A細胞損傷中的作用，通過添加雷帕霉素(50nmol/L)和

4、氯喹（5μmol/L）來升高和降低細胞自噬水平，MTT法檢測自噬水平的變化對細胞存活率的影響。結果表明，與鎘處理組相比，自噬水平的上升可以顯著提高細胞存活率(P＜0.05)，自噬水平的下降顯著降低細胞存活率(P＜0.05)。這些結果說明自噬對鎘致BRL3A細胞損傷具有一定的保護作用。
　　3.PI3K/Akt/mTOR通路在鎘致BRL3A細胞自噬中的作用
　　為了探究PI3K/Akt/mTOR通路在鎘致BRL3A細胞自噬中的

5、作用，分別用0、2、4、8μmol/L的醋酸鎘處理細胞4h，免疫印跡法檢測PI3K/Akt/mTOR通路中關鍵蛋白的磷酸化水平;加入PI3K抑制劑LY294002（40μmol/L）與8μmol/L醋酸鎘單獨或聯(lián)合處理細胞4h，檢測Akt蛋白磷酸化水平和LC3含量的變化，MDC染色觀察晚期自噬溶酶體的變化。結果表明，與對照組相比，隨著鎘濃度的上升，PI3K、Akt、mTOR、P70S6K蛋白的磷酸化水平逐漸下降;8μmol/L時各蛋白磷