bFGF促進高糖抑制血管內皮細胞遷移機制研究.pdf

1、目的：
　　1.為了研究血管生成，我們建立了Ⅰ型糖尿病大鼠模型作為對象;
　　2.檢測bFGF是否對高糖抑制的血管內皮細胞增殖和遷移具有緩解作用，及bFGF是否對高糖誘導的凋亡炎癥具有保護作用;
　　3.檢測高糖抑制的血管內皮細胞遷移以及高糖誘導的凋亡是否通過激活bFGF調控的JNK和ERK信號實現(xiàn);
　　4.檢測ROS清除劑是否能減少高糖誘導的細胞內ROS的積累，并且促進高糖抑制的血管內皮細胞的遷移;
　

2、　方法：
　　1.在STZ注射八周后，在大鼠腰部進行全層皮膚切除。HE染色顯示大鼠皮膚治療7天后的血管數(shù)量;
　　2.設置不同濃度bFGF作用不同時間，用CCK-8檢測細胞在高糖條件下的增殖情況，用Western-blot檢測細胞內TNF-α和cleaved Caspase-3蛋白表達情況;
　　3.細胞劃痕實驗檢測分析bFGF，JNK和ERK抑制劑以及ROS清除劑對高糖損傷后的內皮細胞遷移能力的影響，Western-

3、blot檢測高糖刺激后ERK和JNK的磷酸化水平;
　　4.用免疫熒光實驗分析高糖刺激后，bFGF，JNK和ERK抑制劑以及ROS清除劑對血管內皮細胞內active Caspase-3的活性改變;
　　5.用DCFH-DA檢測試劑盒分析高糖刺激后，給予bFGF，JNK和ERK抑制劑以及ROS清除劑對細胞內ROS的水平改變;
　　結果：
　　1.糖尿病組中血管的密度明顯低于非糖尿病組，而給予bFGF治療的糖尿病組血

4、管數(shù)量又有所增多;
　　2.研究發(fā)現(xiàn)高糖明顯抑制細胞增殖和細胞遷移，而bFGF促進高糖損傷后的血管內皮細胞的增殖和遷移，從而抑制了高糖誘導產生的炎癥和凋亡因子(TNF-alpha/cleaved Caspase-3);
　　3.我們研究發(fā)現(xiàn)，血管內皮細胞經高糖刺激后，JNK和ERK的磷酸化水平隨著時間持續(xù)地上調。而血管內皮細胞經bFGF刺激后，JNK的磷酸化短暫地升高了，ERK的磷酸化水平沒有太明顯的變化。此外，高糖誘導JN

5、K和ERK磷酸化水平升高后，再加入bFGF作用30 min，卻使JNK和ERK的磷酸化水平下降了;
　　4.劃痕實驗顯示，在低糖條件下，當加入JNK和ERK抑制劑，細胞遷移受到抑制，相反的，對高糖損傷后的血管內皮細胞給予JNK和ERK抑制劑時，受到高糖抑制的細胞遷移又有所恢復;
　　5.我們發(fā)現(xiàn)高糖刺激的細胞積累了更多的ROS和active caspase-3。在高糖刺激血管內皮細胞72 h后，再加入JNK和ERK的抑制劑s

6、p600125和U0126作用1h，結果發(fā)現(xiàn)這兩種抑制劑顯著的緩解了高糖誘導的ROS的過度產生和active caspase-3的異常激活。此外，高糖損傷后，當加入ROS清除劑MnTmPyP，也減少了ROS的產生，并抑制了細胞的凋亡;
　　6.高糖明顯增加了細胞內的ROS，而清除劑MnTmPyP顯著減少了高糖誘導積累的ROS。此外，受到高糖抑制的細胞遷移也得到了緩解;
　　結論：
　　傷口愈合中血管新生是極其重要的一個

7、過程，而我們研究得出bFGF保護了糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)口血管的生成障礙。
　　我們在細胞培養(yǎng)基中加入了高濃度的葡糖糖來模擬糖尿病患者體內高血糖的環(huán)境。
　　結果顯示bFGF緩解了高糖對血管內皮細胞活性和遷移的損傷，bFGF在多種細胞中能夠激活多個下游信號分子，其中就包括促分裂原激活蛋白激酶家族(MAPKs)。
　　分子生物學實驗證明高糖通過MAPKs(JNK和ERK)通路抑制了細胞遷移。此外，高糖誘導的血管內皮細胞凋亡以及