PAX2、AIB1在人乳腺癌細(xì)胞生長及他莫昔芬治療作用的實驗研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害著女性的生命和健康。近年來我國乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)上升，且發(fā)病年齡呈年輕化。乳腺癌是內(nèi)分泌依賴性腫瘤，雌激素會刺激乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展，并增加乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)率。相比于細(xì)胞毒性藥物治療，內(nèi)分泌治療具有其副作用小、方便服用、效應(yīng)持久，對患者生活質(zhì)量影響小等優(yōu)點(diǎn)，成為乳腺癌最重要的治療手段之一。他莫昔芬（三苯氧胺，tamoxifen TAM）是一種選擇性雌激素受體調(diào)變劑，用于絕經(jīng)

2、前雌激素受體(estrogen receptor, ER)陽性的乳腺癌患者的內(nèi)分泌治療。目前臨床上約40％～50％ ER陽性的乳腺癌患者對抗雌激素治療產(chǎn)生耐藥。但TAM耐藥機(jī)制尚不明確，ER的丟失和變異并不能完全解釋TAM抵抗。
　　本課題的前期研究發(fā)現(xiàn)，抗雌激素藥物——他莫昔芬調(diào)節(jié)CerbB-2基因表達(dá)，繼而調(diào)節(jié)乳腺腫瘤細(xì)胞生長。在此過程中，有兩個基因:PAX2（配對盒基因，Paired box gene）及AIB-1（Ampl

3、ified in breast cancer1，又稱SRC-3）起到很重要的介導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)PAX-2與AIB-1競爭性結(jié)合ER受體以調(diào)控HER-2的轉(zhuǎn)錄，從而決定他莫昔芬對乳腺癌內(nèi)分泌治療的有效性。鑒于此，本文對PAX2和AIB1在雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞生長及他莫昔芬耐藥中的作用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的實驗研究。
　　方法:
　　1、PAX-2、AIB-1基因重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞株的建立
　　1.1細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)

4、染:將PAX-2、AIB-1基因的重組質(zhì)粒(EX-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1))大量提純。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選4-5周，分別得到穩(wěn)定高表達(dá)PAX-2、AIB-1基因的新乳腺癌細(xì)胞株(命名為MCF-7-PAX-2、MCF-7-AIB-1)。設(shè)立陰性質(zhì)粒[EX-NEG-M90（空載）]穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞株為對照（命名為MCF-7-空載）。

5、通過綠色熒光蛋白GFP檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。
　　1.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的驗證:實驗分組:未處理組（MCF-7細(xì)胞）;空載組（MCF-7-空載）;對照組1(MCF-7-AIB1);對照組2(MCF-7-PAX2)。采用RT-PCR、Western blot方法分別檢測四組細(xì)胞株P(guān)AX2mRNA、AIB1mRNA及PAX2、AIB1蛋白表達(dá)量，以驗證獲得的細(xì)胞株為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力及耐藥性的研究<

6、br>　　2.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞荷瘤裸鼠模型的建立和腫瘤體積的測量將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，于裸鼠于右側(cè)背部皮下注射細(xì)胞懸液，使接種細(xì)胞總數(shù)為1.5×107個/只。接種后觀察到腫瘤生長，按公式計算腫瘤體積(Tumor Volume) TV=1/2×LW2。待接種7周后給予他莫昔芬灌胃，觀察處理后腫瘤生長情況。
　　2.2裸鼠成瘤標(biāo)本檢測
　　接種12周后處死小鼠，取出皮下腫瘤，HE染色結(jié)果證實為接種瘤。同時，提取裸鼠腫瘤組

7、織總RNA和總蛋白，進(jìn)行Western Blot和Real time PCR檢測PAX2、AIB1、HER2及增殖相關(guān)因子ki-67的表達(dá)情況。應(yīng)用免疫組化對PAX2、AIB1、HER-2、ki-67特異性表達(dá)情況進(jìn)行檢測。
　　3、統(tǒng)計學(xué)分析
　　每組實驗不少于3次獨(dú)立樣本的重復(fù)，采用SPSS軟件(13.0)進(jìn)行單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)和非參數(shù)檢驗，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，檢驗

8、以P＜0.05為差異有顯著性意義。
　　結(jié)果:
　　1、質(zhì)粒提純情況
　?、偬峒兊腅X-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1)、EX-NEG-M90（空載）質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得約與目的大小一致的條帶。
　?、谧贤夥止夤舛葍x法測定EX-Z4450-M90（PAX-2）、EX-Z5301-M90（AIB-1）、EX-NEG-M90（空載）質(zhì)粒濃度分別為684μg/ml，OD2

9、60/OD280值為1.956;598μg/ml，OD260/OD280值為1.942;962μg/ml，OD260/OD280值為1.959。質(zhì)粒提純成功，純度高，濃度高，可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
　　③提純質(zhì)粒進(jìn)行檢測，質(zhì)粒所測部分堿基序列無錯誤。
　　2、轉(zhuǎn)染效率
　　通過綠色熒光蛋白GFP檢測，MCF-7-PAX-2細(xì)胞、MCF-7-AIB-1細(xì)胞、MCF-7-空載細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80％左右。
　　3、穩(wěn)轉(zhuǎn)株P(guān)A

10、X2、AIB1基因mRNA表達(dá)情況
　　RT-PCR結(jié)果顯示:與未處理組相比，MCF-7-PAX-2細(xì)胞PAX-2mRNA明顯升高，升高至321.08倍(P＜0.05);AIB-1 mRNA無明顯變化。MCF-7-AIB-1細(xì)胞AIB-1 mRNA明顯升高，599.665倍(P＜0.05); PAX-2mRNA無明顯變化。MCF-7-空載細(xì)胞PAX-2mRNA、AIB-1 mRNA均無明顯變化。
　　4、穩(wěn)轉(zhuǎn)株P(guān)AX2、AI

11、B1蛋白表達(dá)情況
　　Western blot結(jié)果顯示:與未處理組相比，MCF-7-PAX-2細(xì)胞PAX-2蛋白相對表達(dá)量為1.677±0.346，明顯升高，升高了67.7％(P＜0.05); AIB-1蛋白相對表達(dá)量為1.162±0.145，無明顯變化。MCF-7-AIB-1細(xì)胞AIB-1蛋白相對表達(dá)量為2.446±1.207，明顯升高，升高了144.56％(P＜0.05);PAX-2蛋白相對表達(dá)量為1.059±0.030，無明

12、顯變化。MCF-7-空載細(xì)胞PAX-2蛋白相對表達(dá)量為1.035±0.040，AIB-1蛋白相對表達(dá)量為1.172±0.258均無明顯變化(P＞0.05)。
　　5、瘤體積測量結(jié)果:
　　①接種3周后四組小鼠均形成腫瘤。
　　②接種5周后，各組間瘤體積即出現(xiàn)明顯區(qū)別。與未處理組相比，MCF-7-PAX-2組腫瘤明顯小于未處理組，瘤體積小于7.36％（P＜0.05）;MCF-7-AIB-1組腫瘤明顯大于未處理組，瘤體積大

13、于13.09％（P＜0.05）;而MCF-7-空載組和未處理組相比差異無顯著性(P＞0.05)。
　　③接種7周后，與未處理組相比， MCF-7-PAX-2組腫瘤體積為876.76±48.11，明顯小于未處理組，瘤體積小于15.69％（P＜0.05）;MCF-7-AIB-1組腫瘤體積為1596.99±64.97，明顯大于未處理組，瘤體積大于53.57％（P＜0.05）;而MCF-7-空載組腫瘤體積為1101.99±93.3，與未處

14、理組相比差異無顯著性（P＞0.05）。
　　④他莫昔芬灌胃5周后，與處理組相比，MCF-7-PAX-2組腫瘤生長速度明顯小于未處理組，27.5％(P＜0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤生長速度明顯大于未處理組，125.75％(P＜0.05);而MCF-7-空載組和未處理組相比差異無顯著性（P＞0.05）。
　　6、接種瘤HE和免疫組化結(jié)果:
　?、貶E染色觀察實驗組和未處理組細(xì)胞形成的皮下腫瘤組織惡性程度無明顯差

15、異，均可見高分裂像，瘤細(xì)胞排列密集形狀近于卵圓形或多邊形。
　　②免疫組化顯示，四組腫瘤PAX-2、AIB-1、HER-2、ki-67均為陽性。與未處理組相比，MCF-7-PAX-2組腫瘤PAX-2強(qiáng)陽性表達(dá)率高(P＜0.05)，HER2強(qiáng)陽性表達(dá)率低(p＜0.05)，AIB-1、Ki-67均無顯著差異(P＞0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤AIB-1強(qiáng)陽性表達(dá)率高(p＜0.05)，HER2、PAX-2、ki-67均無顯著差

16、異（P＞0.05）;而MCF-7-空載細(xì)胞和未處理組相比差異無顯著性P＞0.05）。
　　7、接種瘤RT-PCR結(jié)果顯示:與未處理組相比， MCF-7-PAX-2組腫瘤PAX-2mRNA明顯升高，升高13315.24％(P＜0.05)，AIB-1mRNA、HER2mRNA顯著降低，分別降低67.16％、54.63％(P＞0.05); MCF-7-AIB-1組腫瘤AIB-1 mRNA、HER2mRNA明顯升高，分別升高5801.77

17、％、538.49％(P＜0.05)，PAX-2mRNA顯著降低，降低28.9％（P＞0.05）;MCF-7-空載組腫瘤PAX-2mRNA、AIB-1 mRNA、HER2mRNA和未處理組相比差異無顯著性（P＞0.05）。
　　8、接種瘤Western blot結(jié)果顯示:與未處理組相比，MCF-7-PAX-2組腫瘤PAX-2陽性表達(dá)率升高91.06％（P＜0.05），AIB-1、HER2陽性表達(dá)率分別降低33.86％、38.65％（

18、P＜0.05），Ki-67均無顯著差異（P＞0.05）;MCF-7-AIB-1組腫瘤AIB-1、HER2陽性表達(dá)率分別升高256.71％、270.23％（P＜0.05），PAX-2陽性表達(dá)率降低71.72％（P＜0.05），Ki-67無顯著差異（P＞0.05）;MCF-7-空載腫瘤組PAX-2、AIB-1、HER2表達(dá)情況和未處理組相比差異無顯著性（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、AIB-1高表達(dá)可促進(jìn)ER陽性乳腺癌M

19、CF-7細(xì)胞在體內(nèi)的生長，PAX-2高表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞在體內(nèi)的生長。
　　2、AIB-1高表達(dá)可導(dǎo)致ER陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞對于TAM的敏感性降低，PAX-2高表達(dá)可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞對于TAM的藥物敏感性。
　　3、AIB-1高表達(dá)可促進(jìn)HER-2的表達(dá)，PAX-2高表達(dá)可抑制HER-2的表達(dá)。
　　4、AIB-1高表達(dá)或PAX-2高表達(dá)均不影響ki-67的表達(dá)。
　　5、PAX-2高表達(dá)及AIB-