索拉非尼誘導(dǎo)miR-375的表達(dá)上調(diào)抑制肝癌新生血管生成的功能和機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　利用miRNA芯片和qRT-PCR篩選和確認(rèn)索拉非尼處理前后的肝癌細(xì)胞中差異性表達(dá)的miRNAs。初步探索上述差異表達(dá)miRNAs對(duì)肝癌新生血管生成的調(diào)控功能和潛在分子機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分、索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞miR-375表達(dá)上調(diào)
　　1.加入不同濃度的索拉非尼處理Hep3B、HepG248h，明確索拉非尼對(duì)Hep3B、HepG2的IC50；
　　2.提取索拉非尼處理前后的肝癌細(xì)胞

2、的 RNA行 miRNA芯片檢測(cè)分析，篩選差異表達(dá)的miRNAs；
　　3.miRNA芯片篩選出 miR-375等差異表達(dá) miRNAs的基礎(chǔ)上，利用qRT-PCR檢測(cè)不同濃度的索拉非尼處理前后肝癌細(xì)胞中miR-375的表達(dá)變化；
　　第二部分、miR-375抑制肝癌新生血管生成的功能和機(jī)制研究
　　1.利用qRT-PCR檢測(cè)臨床肝癌組織和癌旁組織中；肝癌細(xì)胞系Hep3B、HepG2、Huh1、Huh7和正常肝細(xì)胞系L

3、O2中miR-375的表達(dá)差異；
　　2.利用過(guò)表達(dá) miR-375的慢病毒感染肝癌細(xì)胞，并用 qRT-PCR確認(rèn)miR-375在肝癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)效率；
　　3.利用CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-375對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲、遷移、凋亡的影響；
　　4.利用 HUVEC血管管腔形成實(shí)驗(yàn)、大鼠主動(dòng)脈環(huán)出芽實(shí)驗(yàn)、雞胚絨毛尿素膜血管生成實(shí)驗(yàn)在體外和體內(nèi)水平分

4、別檢測(cè)miR-375對(duì)肝癌新生血管生成的影響；
　　5.在生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè) miR-375的潛在下游靶基因 PDGFC的基礎(chǔ)上，利用qRT-PCR、Western blotting、IHC檢測(cè)臨床肝癌組織和癌旁組織中PDGFC的表達(dá)差異；
　　6.利用qRT-PCR、Western blotting檢測(cè)肝癌細(xì)胞系Hep3B、HepG2、Huh1、Huh7和正常肝細(xì)胞系LO2中PDGFC的表達(dá)差異；利用慢病毒載體和miR-3

5、75的抑制物分別在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)miR-375，利用 qRT-PCR、Western blotting和 Elisa檢測(cè) PDGFC的表達(dá)變化，明確miR-375對(duì)PDGFC的調(diào)控功能；
　　7.利用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)明確miR-375對(duì)PDGFC調(diào)控的分子機(jī)制；
　　8.在肝癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-375的同時(shí)外源性補(bǔ)充人重組PDGFCC蛋白和用RNAi實(shí)驗(yàn)敲除PDGFC,利用HUVEC血管管腔形成、大鼠主動(dòng)脈環(huán)出芽和

6、雞胚絨毛膜尿素膜血管生成等“挽救實(shí)驗(yàn)”明確miR-375是否通過(guò)直接調(diào)控PDGFC的表達(dá)抑制肝癌新生血管的生成；
　　9.利用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)在整體動(dòng)物水平檢測(cè)miR-375對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)、血管生成及生存時(shí)間的影響；
　　10.在索拉非尼處理肝癌細(xì)胞的同時(shí)，采用miR-375的抑制物下調(diào)表達(dá)miR-375，利用qRT-PCR和Western blottng檢測(cè)PDGFC的表達(dá)變化；明確索拉非尼是否通過(guò)誘導(dǎo)miR-375表達(dá)上調(diào)抑

7、制PDGFC的表達(dá)；
　　第三部分、miR-375調(diào)控肝癌細(xì)胞PDGFC下游信號(hào)通路的初步研究
　　利用 Western blotting檢測(cè)過(guò)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)miR-375后AKT，ERK1/2的磷酸化水平；
　　結(jié)果：
　　第一部分、索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞miR-375表達(dá)上調(diào)
　　1.索拉非尼對(duì)Hep3B、HepG2的IC50分別為2.77uM、3.28uM；
　　2.miRNA芯片結(jié)果顯示：索拉非

8、尼可誘導(dǎo)包括 miR-375在內(nèi)的miRNAs表達(dá)上調(diào)；
　　抑制肝癌新生血管生成；
　　3.qRT-PCR結(jié)果顯示：索拉非尼濃度依賴性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞miR-375表達(dá)上調(diào)；
　　第二部分、miR-375抑制肝癌新生血管生成的功能和機(jī)制研究
　　1.qRT-PCR結(jié)果顯示：miR-375在臨床肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，miR-375在肝癌細(xì)胞系Hep3B、HepG2、Huh1、Huh7中的表達(dá)明顯低于正常肝

9、細(xì)胞系LO2；
　　2.慢病毒感染后見(jiàn)大量綠色熒光蛋白表達(dá)， qRT-PCR結(jié)果顯示：miR-375過(guò)表達(dá)成功；
　　3.CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-375明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-375明顯抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-375明顯抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力；凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-375明顯促進(jìn)肝

10、癌細(xì)胞凋亡；
　　4.HUVEC血管管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-375明顯抑制HUVEC血管管腔形成；大鼠主動(dòng)脈環(huán)出芽實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-375明顯抑制大鼠主動(dòng)脈環(huán)的出芽及生長(zhǎng)；雞胚絨毛尿素膜血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-375明顯抑制雞胚絨毛尿素膜血管生成；
　　5.生物信息學(xué)軟件targetscan7.1預(yù)測(cè)PDGFC可能是miR-375的下游靶基因；qRT-PCR、Western blotting、IHC結(jié)果顯示：

11、臨床肝癌組織中PDGFC的表達(dá)明顯高于癌旁組織；
　　6.qRT-PCR、Western blotting結(jié)果顯示：肝癌細(xì)胞系Hep3B、HepG2、Huh1、Huh7中 PDGFC的表達(dá)明顯高于正常肝細(xì)胞系 LO2；qRT-PCR、Western blotting、Elisa結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)miR-375后PDGFC的表達(dá)下降，抑制miR-375表達(dá)后PDGFC的表達(dá)升高；
　　7.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-37

12、5直接作用于PDGFC-3，UTR；
　　8.HUVEC血管管腔形成、大鼠主動(dòng)脈環(huán)出芽、雞胚絨毛膜尿素膜血管生成等“挽救實(shí)驗(yàn)”和RNAi實(shí)驗(yàn)顯示：miR-375直接通過(guò)調(diào)控PDGFC表達(dá)抑制肝癌新生血管生成；
　　9.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-375直接通過(guò)調(diào)控PDGFC表達(dá)抑制腫瘤生長(zhǎng)、減少腫瘤血管的生成，明顯延長(zhǎng)裸鼠的生存時(shí)間；
　　10.qRT-PCR、Western blottng結(jié)果提示：索拉非尼通過(guò)誘導(dǎo)

13、 miR-375表達(dá)上調(diào)抑制PDGFC表達(dá)；
　　第三部分、miR-375調(diào)控肝癌細(xì)胞PDGFC下游信號(hào)通路的初步研究
　　Western blotting結(jié)果提示：過(guò)表達(dá)miR-375明顯抑制AKT、ERK1/2磷酸化；下調(diào)表達(dá)miR-375明顯促進(jìn)AKT、ERK1/2磷酸化；
　　結(jié)論：
　　1.索拉非尼濃度依賴性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞miR-375上調(diào)表達(dá)。
　　2.miR-375通過(guò)抑制PDGFC的表達(dá)抑制肝