石刁柏雌雄株間細(xì)胞學(xué)、內(nèi)源物質(zhì)及分子標(biāo)記研究.pdf

1、石刁柏是世界上廣泛栽培的重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，其雄株比雌株高產(chǎn)且有較強(qiáng)的抗病性和生命力，故雄株特別是超雄株倍受生產(chǎn)者的青睞，但由于直到在開花時(shí)期，雌雄株在形態(tài)上仍難以區(qū)分，因此利用傳統(tǒng)的方法培育純雄株栽培群體費(fèi)時(shí)費(fèi)力。同時(shí)，石刁柏也是研究植物性別決定機(jī)制的模式材料之一，但是由于石刁柏基因組信息缺乏，沒(méi)有建立高密度圖譜，限制了石刁柏分子標(biāo)記輔助育種的應(yīng)用和基于遺傳圖譜的性別決定基因的克隆和性別決定機(jī)制的理解。本研究首先從細(xì)胞學(xué)確定石刁柏的性

2、別決定方式，在此基礎(chǔ)上分析雌雄性別間的生理代謝差異；利用RAPD、AFLP分子標(biāo)記技術(shù)分析其基因組差異信息，開發(fā)性別鑒定的分子標(biāo)記，為石刁柏的高效栽培生產(chǎn)服務(wù)；同時(shí)為石刁柏的性別決定理論機(jī)制的研究提供重要的依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1、石刁柏性染色體的細(xì)胞學(xué)分析。利用常規(guī)細(xì)胞學(xué)技術(shù)對(duì)石刁柏核型、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂、G-帶及DAPI熒光帶進(jìn)行了分析，結(jié)果表明石刁柏核型公式為2n=2x=20=10m+10sm，核型類型為2B型，屬于

3、較原始的類型。減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了異型性染色體的分離行為。證明了石刁柏的性染色體為異形染色體，雌株為XX，雄株為XY，且Y染色體是X染色體長(zhǎng)度的1.65倍；G帶和DAPI帶顯示其X染色體和Y染色體均富含異染色質(zhì)。 2、石刁柏雌雄株花分化時(shí)期的內(nèi)源代謝產(chǎn)物差異比較。對(duì)石刁柏花分化的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、兩性期、減數(shù)分裂及花成熟期四個(gè)時(shí)期的內(nèi)源激素、多胺、氨基酸含量進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所研究的幾種內(nèi)源代謝產(chǎn)物均參與了性別的分化過(guò)程。雌雄性個(gè)體

4、單性性別形成的四個(gè)時(shí)期中，堿性氨基酸和中性氨基酸在四個(gè)時(shí)期的總量變化規(guī)律沒(méi)有性別的差異。而酸性氨基酸的變化趨勢(shì)和雌性性別存在明顯的差異，氨基酸總量在四個(gè)時(shí)期雄株含量明顯高于雌株。 碳氮化合物含量在雌雄性性別分化過(guò)程中均沒(méi)有明顯的變化。而C/N比值在雄性性別分化中從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、兩性期到減數(shù)分裂期，C/N比值顯著降低，而到花完全成熟時(shí)期又開始回升，而雌性變化不顯著。 IAA在雌雄單性花分化中其含量變化規(guī)律沒(méi)有性別差異，GA<,

5、3>、ZRs租ABA含量在花分化過(guò)程中含量變化表現(xiàn)出雌雄差異，其差異主要表現(xiàn)在單性花生理分化結(jié)束后，說(shuō)明內(nèi)源激素并沒(méi)參與單性花性別的決定過(guò)程。腐胺和亞精胺含量在單性花分化過(guò)程中沒(méi)有明顯的性別差異；精胺含量在雌雄單性花分化中其含量變化表現(xiàn)出明顯的性別差異，雄性個(gè)體在小孢子時(shí)期達(dá)到最低值，此后又顯著上升。而雌性則相反，隨著雌性性別的分化精胺含量逐漸從最大值開始降低。多胺總量變化也表現(xiàn)出性別差異，多胺總量隨著生殖器官的分化而逐漸升高，到花完全

6、成熟期達(dá)到最大值；而在雌株中，多胺總量的最大值出現(xiàn)在兩性期的轉(zhuǎn)換期，而此后又逐漸降低。 3、利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)對(duì)石刁柏雌雄株基因組差異進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在100個(gè)隨機(jī)引物中，引物$368在石刁柏基因組中擴(kuò)增出2條雌性相關(guān)的RAPD片斷，它們長(zhǎng)度分別為928bp、1178bp，AT含量分別為62％、64％，Genbank檢索未發(fā)現(xiàn)同源片斷。通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物將$368928片段成功轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定性更高的SCAR標(biāo)記。Sou

7、thern雜交表明$368928片段在雌雄基因組中均有雜交信號(hào)，屬于是多拷貝的重復(fù)序列。通過(guò)熒光原位雜交進(jìn)行染色體定位發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記在雄性中兩對(duì)常染色體、X和Y染色體上出現(xiàn)雜交信號(hào)，雌性中的雜交信號(hào)出現(xiàn)在兩對(duì)對(duì)常染色體和x染色體上。X、Y染色體以及一對(duì)常染色體上的雜交信號(hào)出現(xiàn)在著絲粒附近，而另一對(duì)常染色體的雜交信號(hào)出現(xiàn)在末端。 4、利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)對(duì)石刁柏雌雄株基因組差異進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用的72個(gè)引物組合中，引

8、物組合E-AAG+M-CAT從雄性基因組中擴(kuò)增出了一個(gè)555bp的雄性連鎖的片段(MLDA555)，將獲得的差異條帶進(jìn)行克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)該序列長(zhǎng)度為555bp，AT含量為59％，經(jīng)過(guò)檢索未發(fā)現(xiàn)同源序列。根據(jù)該片段序列設(shè)計(jì)的引物將該標(biāo)記轉(zhuǎn)化為雄性連鎖的大小為523bp的SCAR標(biāo)記，經(jīng)過(guò)不同基因型雄性個(gè)體的驗(yàn)證證明該標(biāo)記廣泛存在于不同基因型石刁柏雄性個(gè)體中。Southem雜交僅在雄性基因組中出現(xiàn)低拷貝的雜交信號(hào)。熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)，在雄性細(xì)胞中