枸杞多糖對(duì)己烯雌酚致倉鼠及雄性后代生精細(xì)胞凋亡的緩解作用.pdf

1、本試驗(yàn)主要研究己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)染毒雄性成年倉鼠對(duì)其睪丸和附睪生精細(xì)胞凋亡及其后代生精細(xì)胞凋亡的影響及枸杞多糖(Lycium barbarumpolysaccharide，LBP)的緩解作用。將90只成年雄性倉鼠正常飼養(yǎng)7d后，隨機(jī)分為6組(n=15)。于末次給藥24 h后，每組均隨機(jī)選取5只倉鼠，乙醚麻醉致死，取出睪丸快速分離睪丸周圍的脂肪，放入波恩氏液中固定，制作石蠟切片，應(yīng)用免疫組化方法測(cè)定C

2、aspase-8、Caspase-9、P53、ER及AR的表達(dá)與定位;另外摘取兩側(cè)附睪，左側(cè)附睪尾放于波恩氏液中固定，制做石蠟切片，HE染色觀察其組織學(xué)變化，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、P53的表達(dá)與定位;右側(cè)附睪尾于37℃生理鹽水中剪碎，取精子懸液觀察精子形態(tài)，計(jì)算精子密度和畸形率。末次給藥24 h后，各試驗(yàn)組均隨機(jī)選取5只雄性倉鼠，與發(fā)情母鼠按1∶2比例合籠，連續(xù)2個(gè)發(fā)情周期(9 d)，每天早晨

3、，對(duì)雌鼠進(jìn)行陰道涂片，鏡檢發(fā)現(xiàn)精子者視為合籠成功，記為孕1d。將懷孕母鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，期間喂給正常的飼料和水，待其分娩。分別記錄每只母鼠妊娠率、妊娠日期、產(chǎn)仔數(shù)、雌雄比例、仔鼠PND0 d、7d、14d、21d、28 d和56 d體重。飼養(yǎng)雄性仔鼠至性成熟，乙醚麻醉致死倉鼠，取睪丸組織，稱量并計(jì)算器官指數(shù)，將睪丸固定在波恩氏液中，制作石蠟切片，觀察組織學(xué)變化，并檢測(cè)睪丸中Fas、FasL及Caspase-3的表達(dá)與定位;分別摘取兩側(cè)附睪，稱

4、重并計(jì)算器官指數(shù)，左側(cè)附睪尾放于波恩氏液中固定，制做石蠟切片，HE染色觀察其組織學(xué)變化;右側(cè)附睪尾于37℃生理鹽水中剪碎，取精子懸液觀察精子形態(tài)，計(jì)算精子密度和畸形率。6個(gè)試驗(yàn)組中剩余的30只雄性倉鼠，繼續(xù)飼喂3個(gè)月，觀察3個(gè)月后倉鼠睪丸的組織學(xué)變化;取附睪，計(jì)算精子密度和畸形率。
　　結(jié)果顯示:(1)F0代成年雄性倉鼠用DES處理后，附睪組織形態(tài)發(fā)生明顯變化;補(bǔ)充LBP后，附睪管上皮細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，損傷明顯減少，尤其是在

5、LBP高劑量組（50 mg/kg）是最明顯的，維生素組附睪組織形態(tài)也得到很好的恢復(fù)，且LBP高劑量組與維生素組無顯著差異。DES顯著降低F0代倉鼠精子數(shù)量，提高精子畸形率(P＜0.01)，而LBP可以提高F0代雄鼠精子數(shù)量，降低畸形率，維生素對(duì)精子數(shù)量和畸形率也有顯著作用。通過免疫組化法檢測(cè)證實(shí)，DES引起F0代成年倉鼠睪丸內(nèi)生精細(xì)胞大量凋亡，顯著提高Caspase-9的表達(dá)(P＜0.01);給予不同劑量的LBP后，Caspase-9及

6、P53的達(dá)呈劑量依賴性降低，以LBP高劑量組表達(dá)最低(P＜0.01)，同時(shí)LBP高劑量組的Caspase-8陽性表達(dá)與對(duì)照組相比差異不顯著。DES顯著降低AR基因的表達(dá)(P＜0.01)，添加LBP后，各治療組AR的表達(dá)量隨LBP劑量升高而增加。DES能夠使ER基因表達(dá)顯著升高，LBP應(yīng)用后ER表達(dá)量均減少。DES可顯著增加F0代倉鼠附睪組織中Caspase-8、Caspase-9及P53的表達(dá)(P＜0.01)，添加LBP后，1/10/5

7、0 mg/kg LBP組凋亡蛋白Caspase-8的表達(dá)較DES降低(P＜0.01)，10/50 mg/kg LBP組Caspase-9的陽性表達(dá)較DES降低(P＜0.01)，50 mg/kg LBP組凋亡蛋白P53的表達(dá)較DES降低(P＜0.01)。(2)與DES組雄鼠交配的10只雌鼠中，僅有4只懷孕，1 mg/kg LBP組和10 mg/kgLBP組雌鼠的妊娠率分別為60％和70％，對(duì)照組、50 mg/kg LBP組和維生素組雄性倉

8、鼠與發(fā)情雌鼠合籠，3個(gè)組中雌鼠全部懷孕。各組間雌鼠妊娠日齡、產(chǎn)仔數(shù)、出生重及仔鼠雌雄比例比較，均差異不顯著。F1代仔鼠PND7 d體重，各組間比較均沒有顯著差異。DES組和維生素組仔鼠PND14 d和PND21 d體重顯著低于對(duì)照組和LBP各劑量組(P＜0.05)，LBP各劑量組仔鼠PND14 d和PND21 d體重與對(duì)照組沒有顯著差異。DES組仔鼠PND28 d體重與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，LBP各劑量組仔鼠PND28 d

9、體重與對(duì)照組相比沒有顯著差異，與對(duì)照組相比，維生素組仔鼠PND28 d體重差異明顯(P＜0.05)。仔鼠成年后(PND56d)體重各組之間比較，維生素組為110.77 g，顯著低于對(duì)照組的135.80 g(P＜0.05)，DES組和LBP各劑量組與對(duì)照組相比沒有明顯差異。F1代倉鼠睪丸重量及其器官指數(shù)各組之間比較，沒有差異。DES組、1/10 mg/kg LBP組和VC+VE組F1代附睪重量及附睪器官指數(shù)和精子數(shù)量低于對(duì)照組，而50 m

10、g/kg LBP組與對(duì)照組相比差異不顯著。DES組、1 mg/kg LBP組F1代倉鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)有輕微損傷，10/50 mg/kgLBP組睪丸組織接近正常;各組間F1代附睪組織形態(tài)正常。各組間F1代倉鼠精子畸形率比較無顯著性差異。DES組、1 mg/kg LBP組F1代睪丸中Fas的表達(dá)較對(duì)照組顯著增高(P＜0.01)，10/50 mg/kg LBP組和維生素組無顯著變化。DES組、1/10mg/kg LBP組F1代睪丸中FasL的陽

11、性表達(dá)較對(duì)照組顯著增高(P＜0.01)，50 mg/kgLBP組和VC+VE組相比差異不顯著。F1代睪丸組織中Caspase-3的陽性表達(dá)，除DES組顯著高于對(duì)照組外其他各組與對(duì)照組相比沒有差異。(3)經(jīng)過3個(gè)月的恢復(fù)后，各組的睪丸和附睪重量及睪丸組織形態(tài)皆恢復(fù)到正常水平，精子畸形率也降低到正常水平，DES組、1/10 mg/kg LBP組和VC+VE組精子數(shù)量顯著低于對(duì)照組，50 mg/kg LBP組恢復(fù)到對(duì)照組水平。各組倉鼠恢復(fù)3個(gè)

12、月后，其體重均較用藥結(jié)束時(shí)有顯著增加(P＜0.01);睪丸重量較用藥結(jié)束時(shí)均有增加，但沒有顯著差異;1 mg/kgDES組和維生素組附睪重量分別增加81.25％和55.81％，但差異不顯著;1 mg/kgLBP組和10 mg/kg LBP組附睪重量恢復(fù)前后比較，差異顯著(P＜0.05);而50 mg/kgLBP組附睪重量由0.46 g增加到0.73 g，差異極顯著(P＜0.01)。經(jīng)過3個(gè)月恢復(fù)后，DES組、1/10 mg/kg LBP

13、組和維生素組精子數(shù)量與結(jié)束用藥時(shí)相比，精子數(shù)量均顯著增加(P＜0.01);50 mg/kg LBP組精子數(shù)量恢復(fù)前后變化不明顯。精子畸形率恢復(fù)前后的比較結(jié)果顯示，各組倉鼠恢復(fù)3個(gè)月后，精子畸形率均較結(jié)束用藥時(shí)顯著降低(P＜0.01)。
　　結(jié)論:(1) DES造成睪丸生精細(xì)胞大量凋亡，改變附睪結(jié)構(gòu)，增加附睪凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9和P53表達(dá)，擾亂AR和ER正常功能，降低精子數(shù)量，增加精子畸形率，導(dǎo)致成年雄性

14、倉鼠生殖損傷，生育能力降低。補(bǔ)充不同劑量的LBP后，LBP減少睪丸生精細(xì)胞和附睪上皮細(xì)胞凋亡，使附睪損傷程度減輕，糾正AR和ER功能，增加精子數(shù)量，減少精子畸形率，緩解DES對(duì)F0代雄性倉鼠造成的生殖損傷。(2) DES對(duì)F1代倉鼠生殖能力造成不良影響，包括降低仔鼠PND14d、21d、28d和56d體重，降低F1代附睪重量及其器官指數(shù)，減少精子數(shù)量，增加睪丸生精細(xì)胞Fas/FasL及Caspase-3蛋白的凋亡。應(yīng)用LBP后，可以緩解