冬凌草甲素誘導HepG2肝癌細胞凋亡及相關信號通路研究.pdf

1、1.研究背景
　　當下癌癥已經成為人類致死的重要因素之一，已經嚴重威脅到人類的身心健康。與發(fā)達國家相比，我國腫瘤發(fā)病率高且有逐年上升的趨向。目前，藥物化療、放療和手術治療是臨床上治療腫瘤的主要手段，即便它們在治療癌癥過程中發(fā)揮了至關重要的作用，但是在藥物治療腫瘤過程中容易出現(xiàn)耐藥性，毒副作用等不良反應，而且制藥成本也逐漸增高，因此探求新型的特異性抗腫瘤藥物的任務顯得尤為迫切。近來年傳統(tǒng)中藥越來越受到人們的關注，因其毒副作用小，價格

2、低廉，來源廣泛，種類繁多等優(yōu)勢。冬凌草甲素是從唇形科植物中分離提取的一種無色棱柱狀結晶，無色，味苦，不溶于水的貝殼杉烯二萜類天然化合物。冬凌草甲素對多種腫瘤細胞如胰腺癌、宮頸癌、肝癌等多種腫瘤細胞有明顯的抑制作用。盡管目前人們對冬凌草甲素抗癌作用及其抗癌作用機制研究展開了大量的研究，但其作用于腫瘤細胞的信號路徑及其特點仍有許多未解之處，不能有效安全的為臨床用藥提供指導。本文運用現(xiàn)代分子生物學技術進一步揭示冬凌草甲素作用于腫瘤細胞的機制，

3、進一步為臨床用藥提供理論依據(jù)。
　　2.研究目的
　　研究冬凌草甲素誘導HepG2肝癌細胞凋亡及其相關信號通路
　　3.研究方法
　　3.1.冬凌草甲素濃度從低到高作用于HepG2肝癌細胞24h后，MTT法檢測冬凌草甲素對該腫瘤細胞的抑制率及其生長曲線；結晶紫法觀察藥物作用細胞數(shù)量的變化
　　3.2.不同濃度冬凌草甲素作用HepG2肝癌細胞后，用流式細胞儀檢測冬凌草甲素對HepG2肝癌細胞細胞周期分布的影響

4、；
　　3.3.Western blotting檢測不同藥物濃度的冬凌草甲素作用于HepG2后ATR和P-ATR、ATM和P-ATM、CHK1和P-CHK1、Cdk1和P-Cdk1、、H2AX和γ-H2AX、CDC25C和P-CDC25C等與細胞周期引起凋亡相關蛋白的表達影響。
　　4.結果
　　4.1.MTT法檢測結果顯示：低濃度冬凌草甲素對肝癌HepG2細胞抑制作用較弱，高濃度冬凌草甲素對肝癌HepG2細胞抑制作用

5、較強，抑制率呈劑量依賴性；結晶紫法顯示：冬凌草甲素藥物濃度越高，結晶紫染色越少，細胞存活率越低，存活細胞數(shù)量越少。
　　4.2.流式細胞儀檢測顯示：冬凌草甲素阻滯HepG2肝癌細胞于G2/M期，冬凌草甲素藥物濃度越高，HepG2肝癌細胞處于G2/M期的數(shù)量越多。
　　4.3.Western blotting檢測技術檢測冬凌草甲素對HepG2肝癌細胞相關蛋白顯示：不同濃度的冬凌草甲素作用HepG2肝癌細胞24h后，其Weste

6、rn印跡結果表明，隨著藥物濃度增加，P-ATM、P-ATR、γ-H2AX、P53、Phos-P53、P-CDC25C、P-Cdk1、P-CHK1、P-CHK2蛋白在細胞體內表達增加，CDC25C，Cdk1蛋白表達逐漸減少，CyclinB1蛋白表達則無差別。
　　5.結論
　　冬凌草甲素可明顯抑制HepG2肝癌細胞增殖，其細胞IC50為：（31.92±1.8）μmol/L；冬凌草甲素在抑制HepG2肝癌細胞生長過程中，與細胞周