流體力學注射IL-36Ra質粒對ConA誘導小鼠肝損傷的保護作用.pdf

1、目的：
　　白細胞介素(interleukin，IL)-36亞家族包括五位成員：IL-36a、IL-36b、IL-36γ、IL-36受體拮抗劑(IL-36 receptor antagonist，IL-36Ra)和IL-38。IL-36Ra之前又被稱作IL-1家族5(IL-1 family5，IL-1F5)、FIL-1δ和IL-1δ。IL-36Ra與IL-1受體相關蛋白2(IL-1 rece ptor-related protei

2、n2，IL-1Rrp2)結合后因不具有IL-36a、IL-36b及IL-36γ所具有的B4/5和b11/12循環(huán)結構，從而阻礙IL-1受體輔助蛋白(IL-1 receptor accessory protein，IL-1R AcP)的募集和功能性信號復合體的形成，最終可抑制轉錄因子(nuclear factor，NF)-?B和絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路發(fā)揮其生

3、物學功能。近年來，肝臟疾病的全球內發(fā)病率一直居于首位，其中肝炎尤為突出，病毒感染是引起肝炎的主要原因，病毒性肝炎的主要發(fā)病機制是病毒抗原進入人體后引起的人一系列的免疫反應從而造成肝損傷。刀豆蛋白A(concanavalinA，ConA)誘導的急性小鼠肝損傷能夠很好地模擬病毒性肝炎與自身免疫性肝炎。因此，本研究擬克隆人IL-36Ra基因，構建其真核、原核表達載體，構建ConA誘導小鼠肝損傷模型，利用ConA誘導的肝損傷模型，從分子水平和動

4、物水平研究IL-36Ra的過表達在免疫性肝炎中的作用，并初步探討其作用機制，為臨床肝病的治療提供理論和實驗依據。
　　方法：
　　1.從人皮膚中提取總RNA，設計引物通過RT-PCR方法擴增IL-36Ra基因的全長編碼序列，將其克隆入真核表達載體pcDNA3.1/V5-His中，構建其重組質粒pcDNA-3.1-hIL-36Ra-V5-His；以pcDNA-3.1-hIL-36Ra-V5-His為模板擴增IL-36Ra成熟蛋

5、白編碼區(qū)，構建IL-36Ra原核表達載體pET-44-hIL-36Ra。
　　2.構建ConA誘導的肝損傷動物模型：將BALB/c小鼠分為4組，每組12只，正常對照組注射等量生理鹽水，其余3組小鼠分別注射ConA制備肝損傷模型(ConA誘導劑量為15 mg/kg)。將構建的質粒pcDNA3.1-hIL-36Ra-V5-His以尾靜脈注射方式提前1 d注射到小鼠體內，在造模第8小時和第24小時分別處死部分小鼠，收集樣本。小鼠肝組織病

6、理學變化通過蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)方法檢測，小鼠血清中轉氨酶水平的檢測采用丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase，AST)法，相關細胞因子和趨化因子含量的測定則通過逆轉錄PCR和細胞因子的酶聯免疫吸附法測定(enzyme-linked immuno sorbent as

7、say，ELISA)。
　　結果：
　　1.將擴增出人IL-36Ra的基因序列插入到pcDNA3.1/V5-His中，成功構建了IL-36Ra原核、真核表達載體，測序結果均與GenBank中的基因序列一致。
　　2.造模8 h、24 h分批處死小鼠，心臟采血后，實驗組小鼠血清中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF)-a、干擾素(interferon，IFN)-a、IL-17、AST和ALT水

8、平在注射ConA后8 h較ConA模型組和陰性對照組均有降低(P<0.01)，小鼠肝組織切片經HE染色，光學顯微鏡下可觀察到注射IL-36Ra重組質粒的小鼠肝臟損傷均較模型組和陰性對照組有不同程度的減輕，趨近空白對照組結果。
　　結論：
　　成功構建了IL-36Ra原核和真核表達載體。并將其真核載體pcDNA-3.1-hIL-36Ra-V5-His采用無內毒素質粒大提試劑盒提取后采用高壓流體力學注射方式注射到肝損傷模型小鼠體