PI3-K-Akt通路介導(dǎo)野薔薇苷對(duì)抗急性缺氧性腦水腫及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的：本課題組前期研究表明，野薔薇苷（Rosamultin）是藏藥“蕨麻”中提取的活性單體成分，可以發(fā)揮抗氧化、抗缺血、耐缺氧損傷等多種藥理活性作用，能夠明顯減輕缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和心肌細(xì)胞損傷。但目前關(guān)于野薔薇苷的體內(nèi)抗缺氧活性及其抗缺氧分子調(diào)控機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，以清潔級(jí)SpragueDawley大鼠為研究對(duì)象，建立急性低壓缺氧損傷模型，觀察野薔薇苷對(duì)急性低壓缺氧誘發(fā)大鼠腦水腫的保護(hù)作用，并

2、初步探討其作用機(jī)制。由于急性缺氧性腦水腫與血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能失調(diào)密切相關(guān)，因此，本課題進(jìn)一步通過(guò)體外血管內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧損傷模型，深入分析野薔薇苷對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)調(diào)控，從而探討野薔薇苷對(duì)抗急性缺氧性腦損傷的分子機(jī)制。
　　方法：研究?jī)?nèi)容分為兩部分。
　　第一部分：野薔薇苷對(duì)急性低壓缺氧大鼠腦損傷的保護(hù)作用及對(duì)pAkt蛋白的表達(dá)調(diào)控
　　1、實(shí)驗(yàn)分組：將50只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組：常氧對(duì)照組（C），

3、缺氧模型組（M），野薔薇苷高劑量組（H），野薔薇苷低劑量組（L），地塞米松組（N）。
　　2、急性低壓缺氧模型的建立：除常氧對(duì)照組外，其他各組均采用低壓氧艙建立大鼠急性低壓缺氧模型，模擬海拔7000m高原環(huán)境（溫度15±2℃，濕度30％±5%）缺氧18h。常氧對(duì)照組大鼠相同溫、濕度艙外正常飼養(yǎng)。
　　3、采用生化手段檢測(cè)各組大鼠腦海馬組織中LDH、SOD活性和MDA、GSH含量，以及血漿中NO含量。
　　4、采用干濕比

4、重法計(jì)算各組大鼠腦含水量，觀察各組大鼠腦水腫情況。
　　5、通過(guò)H.E染色法觀察各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化。
　　6、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法，觀察各組大鼠腦組織中AQP1和AQP4表達(dá)變化情況。
　　7、利用免疫印跡技術(shù)（WesternBlot），觀察各組大鼠腦組織中pAkt蛋白表達(dá)變化情況。
　　第二部分：PI3-K/Akt通路介導(dǎo)野薔薇苷對(duì)抗急性缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制研究
　　1、實(shí)驗(yàn)分組：取對(duì)數(shù)

5、生長(zhǎng)期的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy926細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（C）、PI3K抑制劑（LY294002）高、中、低濃度處理組（LY20、LY10、LY5）、缺氧模型組(M)、缺氧+LY294002高、中、低濃度處理組（M+LY20、M+LY10、M+LY5）、缺氧+野薔薇苷處理組（Y10）、缺氧+野薔薇苷+LY294002高、中、低濃度處理組（Y10+LY20、Y10+LY10、Y10+LY5）、缺氧+野薔薇苷+2-Methoxye

6、stradiol處理組（Y10+2-Me）。
　　2、急性缺氧損傷模型的建立：利用三氣培養(yǎng)箱建立急性缺氧損傷模型（5%CO2,95%N2,37℃），缺氧2h，正常對(duì)照組細(xì)胞同步培養(yǎng)于二氧化碳培養(yǎng)箱（5%CO2,37℃）。
　　3、通過(guò)MTT法觀察各組細(xì)胞代謝活力的變化；采用生化手段檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH外漏量以及各組細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH含量和SOD、CAT活性。
　　4、通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞

7、膜完整性和存活率。
　　5、運(yùn)用Hochest/PI雙重染色和DAPI染色技術(shù)，觀察各組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。
　　6、采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率。
　　7、通過(guò)免疫熒光細(xì)胞染色法，觀察各組細(xì)胞中pAkt的表達(dá)情況，探討野薔薇苷對(duì)缺氧損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞中Akt磷酸化水平的調(diào)控作用。
　　8、利用WesternBlot技術(shù)，觀察各組細(xì)胞中Akt,pAkt,HIF-1α,HIF-1β,Bax,Bcl

8、-2,CytC,Caspase-9,pro-Caspase-3,cleaved-Caspase-3等蛋白表達(dá)變化，探討野薔薇苷減輕缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　第一部分：野薔薇苷對(duì)急性低壓缺氧大鼠腦損傷的保護(hù)作用及對(duì)pAkt蛋白的表達(dá)調(diào)控
　　1、與常氧對(duì)照組相比，急性低壓缺氧模型組大鼠腦海馬中LDH活性和MDA含量均顯著上升（P＜0.01），GSH含量、SOD活性和血漿中NO含量均顯著下降

9、（P＜0.01或P＜0.05）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷高、低劑量組和地塞米松組大鼠腦海馬中LDH活性和MDA含量均顯著下降（P＜0.01），GSH含量、SOD活性和血漿中NO含量均顯著上升（P＜0.01或P＜0.05）。
　　2、與常氧對(duì)照組相比，急性低壓缺氧模型組大鼠腦含水量顯著增加（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷高、低劑量組和地塞米松組大鼠腦含水量均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。
　　3、H.E

10、染色結(jié)果顯示：急性低壓缺氧模型組大鼠軟腦膜與腦皮質(zhì)明顯分離，間隙可見(jiàn)大量紅染細(xì)胞，腦皮質(zhì)中毛細(xì)血管周?chē)g隙變大，腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或壞死；給予不同劑量野薔薇苷和地塞米松處理后均能明顯改善缺氧導(dǎo)致的大鼠腦組織病理學(xué)改變。
　　4、免疫組化結(jié)果顯示：與常氧對(duì)照組相比，急性低壓缺氧模型組大鼠腦組織中AQP1和AQP4陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量均顯著增多（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷高、低劑量組和地塞米松組大鼠腦組織中AQP1和

11、AQP4陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量均顯著減少（P＜0.01）。
　　5、與常氧對(duì)照組相比，急性低壓缺氧模型組大鼠腦組織中pAkt表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷高劑量組大鼠腦組織中pAkt表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。
　　第二部分：PI3-K/Akt通路介導(dǎo)野薔薇苷對(duì)抗急性缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制研究
　　1、MTT結(jié)果顯示：與缺氧模型組相比，LY294002高、中、低濃度組血管內(nèi)皮細(xì)胞代

12、謝活力均顯著降低（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷組血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝活力顯著提高（P＜0.01）；與野薔薇苷組相比，野薔薇苷和LY294002共處理組血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝活力顯著降低（P＜0.01）。
　　2、酶學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH外漏量及細(xì)胞內(nèi)MDA含量均顯著增多（P＜0.01），GSH含量及CAT、SOD活性均顯著降低（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷組血管

13、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH外漏量及細(xì)胞內(nèi)MDA含量均顯著降低（P＜0.01），GSH含量及CAT、SOD活性均顯著升高（P＜0.01）；與野薔薇苷組相比，野薔薇苷和LY294002共處理組細(xì)胞LDH外漏量及細(xì)胞內(nèi)MDA含量均顯著增多（P＜0.01或P＜0.05），GSH含量及CAT、SOD活性均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。
　　3、臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P＜0.01）；與缺氧

14、模型組相比，野薔薇苷組藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01）；與野薔薇苷組相比，野薔薇苷和LY294002共處理組藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P＜0.01）。
　　4、Hochest/PI雙染和DAPI染色結(jié)果顯示：野薔薇苷處理能夠明顯減少缺氧誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，給予LY294002可抵消野薔薇苷的保護(hù)作用。
　　5、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野

15、薔薇苷組細(xì)胞凋亡率顯著下降（P＜0.01）；與野薔薇苷組相比，野薔薇苷和LY294002共處理組細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜0.01）。
　　6、免疫熒光染色結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞中FITC標(biāo)記的綠色熒光（pAkt）強(qiáng)度極其微弱，缺氧后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，野薔薇苷處理后熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，但給予LY294002處理可明顯降低細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度。
　　7、Westernblot結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組血管內(nèi)皮細(xì)胞中pAk

16、t、HIF-1α表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷組細(xì)胞中pAkt、HIF-1α表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與野薔薇苷組相比，野薔薇苷和LY294002共處理組pAkt、HIF-1α表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。
　　8、Westernblot結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組血管內(nèi)皮細(xì)胞中Bax、CytC、Caspase-9、cleaved-Caspase-3表達(dá)水平均顯著升高（P＜

17、0.01），Bcl-2和pro-Caspase-3表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與缺氧模型組相比，野薔薇苷處理組血管內(nèi)皮細(xì)胞中Bax、CytC、Caspase-9、cleaved-Caspase-3表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），Bcl-2和pro-Baspase-3表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與野薔薇苷組相比，野薔薇苷和LY294002共處理組及野薔薇苷和2-Me共處理組細(xì)胞中Bax、CytC、Caspase-9、cle

18、aved-Caspase-3表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），Bcl-2和pro-Caspase-3表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、野薔薇苷可通過(guò)提高大鼠的抗氧自由基能力，對(duì)急性低壓缺氧誘導(dǎo)的大鼠腦損傷起保護(hù)作用。
　　2、野薔薇苷可通過(guò)抑制AQP1和AQP4的過(guò)表達(dá)，減輕急性低壓缺氧誘發(fā)的大鼠腦水腫。
　　3、野薔薇苷對(duì)抗急性低壓缺氧性腦損傷的作用可能與其上調(diào)pAkt的表達(dá)有關(guān)。