Argonaute2蛋白的泛素化調控.pdf

1、目的：RNA干擾（RNAi）是一種細胞在進化過程中保留的在轉錄后水平對基因表達進行沉默或抑制的調控方式。RNAi作用廣泛存在于真核細胞中。在真核細胞中，RNAi過程主要由小干擾RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）介導完成。siRNA或miRNA識別并結合Argonaute2（Ago2）蛋白后形成RNAi的效應器—RNA誘導沉默復合物（RISC）。RISC介導siRNA或miRNA對于靶mRNA的識別及切割，在RNAi過程中發(fā)揮

2、了至關重要的作用。因此RISC的核心組分Ago2蛋白被稱為RNAi裝置的催化引擎。因此對于核心分子Ago2的調控研究有助于深入了解RNAi的作用過程。本實驗室前期工作中，通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了Ago2的相互作用蛋白26S蛋白酶體ATP酶亞基3（PSMC3）和 RBBP6。并證實了 PSMC3可以通過泛素化-蛋白酶體途徑依賴的方式調節(jié)Ago2蛋白的穩(wěn)定性，然而具體的分子機制尚不明確。本課題擬從泛素化角度展開PSMC3和RBBP6蛋白對

3、Ago2蛋白的穩(wěn)定性調控機制的研究。
　　方法：首先，利用溶酶體及蛋白酶體抑制劑處理細胞，檢測Ago2蛋白水平及泛素化水平的變化。然后，通過檢索 BioGRID數據庫選定 PSMC3可能的相互作用分子USP14為候選研究對象。其后，通過免疫共沉淀實驗、免疫熒光結合共聚焦顯微鏡采集圖像分析、放線菌酮實驗、Western blot及免疫沉淀等實驗驗證了PSMC3為USP14的相互作用蛋白并且Ago2是USP14的作用底物且USP14可

4、以調控Ago2的泛素化水平。隨后，通過構建USP14的不同突變體并結合免疫共沉淀分析確定了USP14與Ago2及PSMC3相互作用的結構域；通過Western blot實驗確定了PSMC3對于Ago2的穩(wěn)定作用依賴于USP14。同時，通過免疫共沉淀實驗初步驗證了RBBP6與Ago2蛋白的相互作用，并通過Western blot實驗確定了RBBP6可以促進Ago2蛋白的泛素化并增強Ago2的降解。最后，通過Western blot實驗確定

5、了RBBP6，PSMC3及USP14對于RNAi作用的影響。
　　結果：蛋白酶體抑制劑可以促進泛素化的Ago2蛋白在體內的累積。USP14可以分別與PSMC3及Ago2相互作用。干擾USP14可以明顯縮短Ago2蛋白的半衰期。USP14特異性抑制劑能夠促進泛素化的 Ago2在細胞內累積。 USP14可以調控Ago2蛋白的水平且MG132使得此調控作用消失。確定了USP14分別與PSMC3及Ago2相互作用的最小結構域。RBBP6與