遺傳性凝血酶原缺陷癥的臨床及基因分析.pdf

1、目的：
　　先天性凝血因子缺陷癥是一類遺傳性出血性疾病。除血友病甲、乙外，其他均為罕見的常染色體隱性疾病。本疾病發(fā)病率低，常幼年發(fā)病，終身受累，臨床表現(xiàn)多樣且存在一定的異質(zhì)性，有的終身無出血表現(xiàn)，有的出血嚴(yán)重，甚至顱內(nèi)出血。對本類疾病發(fā)生緊密相關(guān)基因突變的致病機(jī)理研究，有助于明確診斷、合理治療和優(yōu)生優(yōu)育，同時(shí)也能夠更深入認(rèn)識各相關(guān)凝血因子的蛋白結(jié)構(gòu)關(guān)系，為相關(guān)因子的功能研究提供分子基礎(chǔ)，進(jìn)一步完善和充實(shí)機(jī)體凝血機(jī)制。本研究對1例先

2、天性凝血酶原缺陷癥家系的臨床特點(diǎn)及基因進(jìn)行研究，為人類凝血酶原缺陷癥的臨床及凝血酶原的結(jié)構(gòu)功能研究提供新思路。
　　方法
　　1.采用PT一期凝固法檢測部分活化的凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、纖維蛋白原含量(FIB)和凝血酶時(shí)間(TT)，作為遺傳性凝血酶原缺陷的篩查實(shí)驗(yàn);根據(jù)臨床表現(xiàn)及體征，排除肝腎功能異常，結(jié)合ELISA法檢測凝血酶原抗原(FⅡ:Ag)和PT一期凝固法檢測凝血酶原活性(FⅡ:C)作為確診實(shí)

3、驗(yàn)。根據(jù)家系成員臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查，繪制家系圖譜。
　　2.采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)結(jié)合測序?qū)蚁党蓡TF2基因進(jìn)行分析;同時(shí)采用PCR-RLFP技術(shù)分析100例正常人該位點(diǎn)以排除基因多態(tài)性。
　　3.從正常肝組織提取mRNA并構(gòu)建F2真核表達(dá)載體;采用PCR介導(dǎo)的重組質(zhì)粒定點(diǎn)誘變技術(shù)構(gòu)建突變體;利用脂質(zhì)體法(Lipofactamine2000)真核轉(zhuǎn)染并表達(dá)。PT一期凝固法分析各突變體（凝血酶原）活性及Western B

4、lot檢測抗原。
　　結(jié)果：
　　1.先證者男，22歲，無明顯臨床出血表現(xiàn)，凝血酶原抗原為103％，活性僅為2％，屬于遺傳性異常凝血酶原血癥。
　　2.測序發(fā)現(xiàn)先證者的F2基因外顯子13存在新的T24858G純合型突變，致其編碼的凝血酶原發(fā)生Tyr510Asp(Y510D)氨基酸替換，同時(shí)先證者F2基因外顯子6存在T165M的SNP位點(diǎn)。
　　3.體外表達(dá)試驗(yàn)中，野生型及突變型培養(yǎng)上清凝血酶原活性均為2％，抗原也