弓形蟲(chóng)依鈣蛋白酶相關(guān)蛋白基因的cDNA克隆及重組蛋白表達(dá).pdf

1、目的:利用RT-PCR擴(kuò)增弓形蟲(chóng)RH株依鈣蛋白酶相關(guān)蛋白(calpain-related)基因的cDNA片段,通過(guò)RNA點(diǎn)雜交和Northern blot鑒定該蟲(chóng)體calpain-related mRNA分子大小;構(gòu)建原核表達(dá)載體并表達(dá)重組蛋白,為弓形蟲(chóng)的疫苗研究提供后選分子。
　　方法:通過(guò)感染BALB?c小鼠收集剛地弓形蟲(chóng)速殖子,提取蟲(chóng)體總RNA;根據(jù)弓形蟲(chóng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)((http://www.toxodb.org)提供的推測(cè)c

2、alpain-related mRNA序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增弓形蟲(chóng)calpain-related cDNA片段,所獲得的cDNA片段植入pGEM-T載體,提取重組質(zhì)粒,經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ雙酶切法及測(cè)序鑒定cDNA序列;再經(jīng)雙酶切將該cDNA片段插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET32-a,重組表達(dá)載體經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ酶切及測(cè)序鑒定后,轉(zhuǎn)化E. coli BL21感受態(tài)宿主菌,并以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)calpain-rel

3、ated重組蛋白,用SDS-PAGE鑒定重組蛋白分子量及蛋白表達(dá)量。用calpain-related cDNA片段制備核酸雜交探針,用RNA點(diǎn)雜交(Dot-blot)和Northern blot觀察該基因在弓形蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)及calpain-related mRNA分子大小。
　　結(jié)果:瓊脂糖凝膠電泳分析表明所提取的弓形蟲(chóng)總RNA28SrRNA與18SrRNA的比值大于1,條帶清楚。用calpain-related特異引物經(jīng)RT-PC

4、R擴(kuò)增后獲得弓形蟲(chóng)RH株calpain-related cDNA片段約500bp,與預(yù)期值相符。將該cDNA片段植入pGEM-T載體后經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定,該cDNA片段長(zhǎng)500bp, DNA序列與弓形蟲(chóng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)提供的推測(cè)calpain-related mRNA序列完全一致。所構(gòu)建的pET32a?calpain-related表達(dá)載體經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定表明表達(dá)載體框架和序列正確,該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21宿主菌后在IPTG的

5、誘導(dǎo)下可大量表達(dá)重組蛋白,所表達(dá)的重組蛋白分子量約26kD,與預(yù)期分子量相符。宿主菌所表達(dá)的重組蛋白經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖親和層析分離柱純化后獲得大量重組蛋白。RNA Dot-blot結(jié)果表明calpain-related基因在蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá);Northern blot結(jié)果提示弓形蟲(chóng)calpain-related mRNA的大小約6800bp。
　　結(jié)論:本研究成功克隆出弓形蟲(chóng)calpain-related cDNA片段,并成功構(gòu)建pE