磷脂酶Dα1和磷脂酸在擬南芥響應鹽和干旱脅迫中的作用及其機理.pdf

1、鹽害引起植物細胞內離子毒害、滲透脅迫,破壞胞內離子平衡,進而引起一系列次級脅迫,并最終導致植株代謝失調,甚至死亡。磷脂酶D(phospholipase D,PLD)廣泛存在于細菌和高等動、植物中,它能夠水解磷脂,產生磷脂酸(phosphatidic acid,PA)和極性頭部。研究表明PLD與PA在植物生長發(fā)育、響應環(huán)境刺激和激素信號等過程中起重要作用。NaCl可誘導綠藻、番茄、苜蓿和擬南芥等高等植物PLD基因表達和活性升高；而PLDα

2、l是已檢測的植物中普遍存在、豐度最高的PLD同工酶,但對于它調控植物適應鹽脅迫機理方面的研究還很少。本研究以Columbia生態(tài)型擬南芥(野生型)、T-DNA插入敲除PLDαl突變體(pldαl)、RNA干擾MPK6突變體MPK6-RNAi為材料,主要研究了PLDαl、PA及MPK6在鹽脅迫中的作用及相互關系。研究結果如下:
　　 首先通過測定NaCl脅迫下野生型及pldαl突變體的種子萌發(fā)率、存活率、干物質積累量、根部生長量、

3、葉片細胞膜透性等生長和生理指標,系統(tǒng)比較了野生型和pldαl突變體的耐鹽能力。實驗結果顯示,在鹽脅迫下野生型種子萌發(fā)率、幼苗生長量均顯著高于pldαl突變體；而葉片細胞電導率則顯著低于pldαl突變體。這些結果綜合表明PLDαl缺失導致擬南芥耐鹽能力降低,提示PLDαl在擬南芥對鹽脅迫的適應過程中起正調節(jié)作用。
　　 為進一步探討PLDαl在植物適應鹽脅迫中的作用,我們檢測了鹽脅迫下野生型及pldαl突變體體內PLDα活性的變化

4、,發(fā)現(xiàn),在100 mmol·L-1 NaCl處理30分鐘后野生型幼苗葉片內PLDα活性顯著升高,處理1小時后達到峰值,隨后隨處理時間延長下降到對照水平；而pldαl葉片中的PLDα基本無活性,與對照相比無顯著變化。進一步實驗發(fā)現(xiàn)100 mmol·L-1 NaCl處理30分鐘后野生型體內PA含量升高,并達到pldαl突變體的2倍,之后隨處理時間延長而下降,并與pldαl突變體無顯著差異。同時還發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下野生型中水平顯著升高的PA分別為含

5、有34:2,34:3,34:6,36:3,36:6脂肪酸鏈的PA。加入PLD轉磷?；偁幮砸种苿┱〈家种芇LD水解磷脂產生PA,加重了100 mmol·L-1 NaCl對野生型和pldαl突變體根伸長生長的抑制；而外源PA則減緩了100 mmol·L-1 NaCl對兩種材料根部生長的抑制作用。實驗結果綜合表明PA能夠在一定程度上緩解鹽脅迫的傷害。因此我們認為,PLDαl通過PA介導擬南芥對鹽脅迫的適應過程。隨后還發(fā)現(xiàn),在鹽處理下,野生

6、型葉片中質膜質子泵活性先升后降；但pldαl突變體葉片中質膜質子泵活性變化不大,并且在處理時間內,野生型葉片中質膜質子泵活性一直顯著高于pldαl突變體。用PA體外處理從野生型葉片中提取的質膜膜微囊,發(fā)現(xiàn)100μmol·L-1 PA能夠顯著提高質膜質子泵活性。進一步觀察到,鹽脅迫下野生型幼苗根部Na+含量與pldαl突變體處于同一水平,無顯著性差異,但其葉片中Na+含量則顯著低于pldαl突變體。并且100 mmol·L-1 NaCl處

7、理下兩種材料葉片和根部K+含量均顯著降低,材料間無顯著差異。實驗結果表明缺失PLDαl影響了擬南芥對Na+的吸收和轉運。
　　 MAPK(mitogen-activated protein kinase)的活化被認為可以增強植物對多種脅迫的耐受能力,目前在植物中已發(fā)現(xiàn)鹽脅迫活化多種MAPK,因此人們認為MAPK的活化是植物適應鹽害的一種基本的信號反應。我們發(fā)現(xiàn),鹽脅迫誘導野生型和pldαl突變體幼苗中以MBP為底物的激酶總活性升

8、高,暗示以MBP為底物的激酶參與了擬南芥對鹽脅迫的適應過程；并且野生型顯著高于pldαl突變體,推測鹽脅迫對以MBP為底物的激酶的激活在一定程度上依賴PLDαl。從擬南芥中克隆MPK6的cDNA,并且將MPK6 cDNA截斷得到C-1(889～1188bp)、C-2(589～1188bp)、C-3(229～1188bp)cDNA片段,隨后將它們分別連接至帶有His標簽的表達載體pET-28a(+)當中,在大腸桿菌中誘導重組蛋白表達,得到

9、相應的MPK6全長蛋白和C-1(296～396aa)、C-2(196～396aa)、C-3(76～396aa)蛋白片段。利用脂印跡方法檢測到PA能夠特異性結合MPK6,并且能與MPK6被截斷后殘余的C末端結合,推測MPK6的C末端中存在著導致其與PA結合的結合位點。Hogl(high osmolarity glycerol)能磷酸化Nhal(Na+/H+逆向轉運體)和TOK1(K+離子通道到)等與鹽脅迫相關的蛋白,促使酵母適應鹽脅迫,通

10、過比對發(fā)現(xiàn)MPK6與Hogl39％同源、66％相似,并且酵母功能互補實驗結果顯示MPK6的表達在一定程度上提高了hogl突變菌株的耐鹽性,部分補償了突變體中缺失hogl的影響。進一步分析比較MPK6-RNAi突變體與野生型擬南芥的耐鹽能力,發(fā)現(xiàn)前者耐鹽能力弱于后者,這些實驗結果表明MPK6是介導擬南芥適應鹽脅迫過程的。外施PA能夠提高鹽脅迫下pldαl幼苗干物質積累量和根部生長量,減緩鹽脅迫對pldαl突變體的傷害,但對MPK6-RNA

11、i突變體影響不大,說明擬南芥中MPK6蛋白表達被阻斷的影響,不能通過外源PA而消除。
　　 通過分析比較野生型與pldαl突變體的耐旱性,發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下,與野生型相比,pldαl突變體葉片發(fā)黃、嚴重萎蔫,植株生長被嚴重抑制,葉片相對電導率顯著增高,葉片相對含水量則顯著降低；在干旱脅迫早期,氣孔開度則顯著高于野生型。根據(jù)實驗結果推測PLDαl及PA通過調控氣孔運動,控制水分散失,介導擬南芥對干旱脅迫的響應。
　　 另外我們

12、觀察了ABA對野生型、pldαl突變體種子萌發(fā)的影響,發(fā)現(xiàn)ABA處理下二者種子萌發(fā)率相差不大,但野生型胚軸明顯比pldαl突變體短、細,推測PLDαl及PA轉導ABA信號,介導了ABA對種子萌發(fā)的抑制過程。隨后分別以150 mmol·L-1甘露醇、75 mmol·L-1 NaCl進行干旱和鹽處理,發(fā)現(xiàn)野生型與pldαl突變體內源ABA水平無顯著差異,推測缺失PLDαl并不影響干旱和鹽脅迫誘導ABA含量升高。
　　 上述研究表明,

13、PLDαl及PA介導了擬南芥對鹽和干旱脅迫的響應過程。在鹽脅迫下PLDαl活性及PA水平升高,一方面激活質膜質子泵,為質膜Na+經(jīng)Na+/H+逆向轉運排出胞外提供驅動力；另一方面結合MPK6,通過它轉導鹽信號。此外,結合本實驗室其他研究者前期研究結果,在滲透脅迫下PLDαl和PA調控氣孔開度,減少水分蒸騰。推測PLDαl和PA可能通過調控氣孔開度,減少水分蒸騰,減少隨蒸騰作用向葉片運輸?shù)腘a+,提高植物耐鹽能力。PLDαl及PA轉導AB