血藍蛋白的細菌凝集活性研究.pdf

1、I摘要海洋微生物酶的開發(fā)和利用是實現(xiàn)海洋資源高值化的關鍵技術之一。瓊膠酶（agarase）是可以將瓊膠（瓊脂）降解為瓊膠寡糖的酶。不同聚合度的瓊膠寡糖已被發(fā)現(xiàn)具有越來越多的生理功能活性，生產(chǎn)系列瓊膠寡糖也成為了瓊膠酶的一個主要應用。此外，瓊膠酶還可以用于瓊脂糖電泳中的核酸回收、制備海藻細胞原生質(zhì)體、篩選信號肽序列等。目前的瓊膠酶主要來自海洋細菌。本論文首先采集汕頭海域表層沉積物和富含瓊膠的紫菜藻體樣品，從中篩選得到兩株高產(chǎn)瓊膠酶的海洋細

2、菌HZ105和ZC1。通過對菌株的常規(guī)特性分析和分類鑒定，菌株HZ105歸屬于Agarivans，命名為Agarivanssp.HZ105。而16SrDNA序列分析結果，同時結合細胞形態(tài)、全細胞脂肪酸組分、碳源利用、部分生理生化性質(zhì)、基因組GC含量等分析表明，菌株ZC1應作為標準菌株建立一個新屬，其中菌株ZC1是一株代表新種的菌株。進一步研究了培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基pH和NaCl濃度對兩菌株生長和產(chǎn)瓊膠酶的影響。其中菌株HZ105在pH710

3、、NaCl濃度為13％范圍內(nèi)培養(yǎng)16h產(chǎn)瓊膠酶最好，說明菌株HZ105偏好堿性環(huán)境生長，其所產(chǎn)瓊膠酶也可能耐堿性。此外，菌株HZ105的胞外瓊膠酶粗酶液在室溫存放2天后還能保持90.9％的酶活力。而菌株ZC1在pH78、NaCl濃度為23％范圍內(nèi)產(chǎn)瓊膠酶最好；但ZC1的營養(yǎng)需求比較特別，只能利用Biolog系統(tǒng)的GN2板95種碳源中葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、淀粉、糊精等少數(shù)碳源。不過菌株ZC1的瓊膠酶不是只由瓊脂誘導產(chǎn)生，這也是其獨特之處

4、，使運用廉價的碳源生產(chǎn)瓊膠酶成為可能。采用從聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠回收蛋白的方法分離純化了菌株HZ105的三個胞外瓊膠酶，并通過SDSPAGE電泳測得了其分子量54kDa、58kDa、105kDa，接著運用串聯(lián)質(zhì)譜技術鑒定了該三個瓊膠酶，發(fā)現(xiàn)這三個酶均為β瓊膠酶，屬于糖基水解酶50家族。根據(jù)瓊膠酶的串聯(lián)質(zhì)譜結果和Genbank中已報道的相關瓊膠酶基因信息，設計引物，通過PCR技術從菌株HZ105中克隆了一段分子量約為105kDa的瓊膠酶

5、的編碼基因，成熟蛋白編碼序列長2931bp，將該基因序列比對NCBI的CDD保守區(qū)數(shù)據(jù)庫，未搜索到保守區(qū)，說明其可能存在新的活性催化部位。將該基因與pET32a()構建重組表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，初步探索了瓊膠酶基因的重組表達。關鍵詞：菌株鑒定；瓊膠酶；分離純化；基因克??；重組表達；串聯(lián)質(zhì)譜IIImatchedthreeβagarasesbelongedtoglycosylhydrolasefamily50bytheanalysisof

6、temmassspectrometry.Basedontheresultoftemmassspectrometrythegeneofthe105kDaextracellularagaraseofstrainHZ105wasclonedusingPCRmethodthecodingsequenceofwhichwas2931bp.AftersubmittingthisgenesequencetotheCDDdatabaseonthewen

7、siteofNCBInoconserveddomainwasfoundwhichsuggestedthepresenceofanewcatalyticdomain.TheexpressionofthisgenewasstudiedinE.colistrainusingvectpET32a()ftheconstructionofrecombinant.Keywds:identificationagarasepurificationclon