哮喘的免疫調(diào)節(jié)以及靶向治療研究.pdf

1、支氣管哮喘是由多種細(xì)胞包括氣道的炎癥細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞（如嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等）以及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。這種慢性炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，通常出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受限，并引起反復(fù)發(fā)作性的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，多數(shù)患者可自行緩解或經(jīng)治療后緩解。全世界大約有3億哮喘患，哮喘在全世界的患病率從1％到18％不等，中國(guó)約有3千萬(wàn)哮喘患者，是全球哮喘病死率最高的國(guó)家之一。伴隨著全球

2、工業(yè)化的進(jìn)展以及環(huán)境污染的加重，哮喘的發(fā)病率和病死率一直居高不下。哮喘不僅會(huì)對(duì)患者甚至社會(huì)造成較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且也會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，探索哮喘的潛在發(fā)病機(jī)制，并針對(duì)性的開(kāi)創(chuàng)有效的治療策略具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，輔助性T細(xì)胞2型(T help cell2，Th2)相關(guān)細(xì)胞因子及其所促使的黏液分泌細(xì)胞增生、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化參與過(guò)敏性哮喘的發(fā)病與維持，并與癥狀嚴(yán)重程度呈正相關(guān);相反，輔助性T細(xì)胞1

3、型(T help cell，Th1)分泌的γ干擾素(IFN-γ)可以抑制Th2的增殖而發(fā)揮炎癥抑制作用。Th1功能相對(duì)抑制、Th2功能相對(duì)亢進(jìn)的Th1/Th2失衡，所導(dǎo)致的IgE合成增加及白介素4（IL-4）、IL-5、IL-13等Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生是哮喘發(fā)病的主要機(jī)制，因此，Th1/Th2軸及其失衡被認(rèn)為與哮喘的發(fā)病和進(jìn)展關(guān)系最為密切。但是這一理論并不能解釋所有類(lèi)型哮喘的發(fā)病機(jī)制。傳統(tǒng)意義上的Th2/嗜酸粒細(xì)胞相關(guān)因子介導(dǎo)的哮喘，

4、約占哮喘發(fā)病的41％，而發(fā)病機(jī)制、病理特征與此不同的非嗜酸性粒細(xì)胞型哮喘約占59％，后者很難用Th1/Th2失衡這一觀點(diǎn)解釋。依據(jù)哮喘患者痰液、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)以及支氣管肺組織中浸潤(rùn)的主要炎癥細(xì)胞種類(lèi)，可將哮喘分為嗜酸性粒細(xì)胞型以及非嗜酸性粒細(xì)胞型。Th17/IL-17的發(fā)現(xiàn)與研究完善了Th1/Th2軸失衡為哮喘發(fā)病機(jī)制這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)，Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17與

5、哮喘，特別是重癥哮喘或激素抵抗型哮喘之間的關(guān)系受到越來(lái)越多的重視，但是目前關(guān)于IL-17在哮喘中的免疫調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)并不統(tǒng)一。基于哮喘患者以及氣道炎癥動(dòng)物模型的研究證明，慢性氣道炎癥疾病中IL-17通過(guò)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)而參與炎癥細(xì)胞的遷移與活化，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在;但是也有文獻(xiàn)證實(shí)在某些情況下IL-17在哮喘的發(fā)病中起到抑制作用。更為深入的研究IL-17對(duì)哮喘發(fā)病的免疫調(diào)節(jié)，有助于我們進(jìn)一步明確哮喘的發(fā)病機(jī)制，探索有效的治療策略。

6、r>　　有規(guī)律的吸入低劑量激素治療是目前控制哮喘最理想的一線治療方法，不過(guò)也存在約10％哮喘患者需要吸入較大劑量激素，有1％的哮喘患者需要口服激素來(lái)控制哮喘發(fā)病，此類(lèi)哮喘患者存在對(duì)激素治療的依賴(lài)性。此外，有小部分哮喘患者對(duì)高劑量的口服激素產(chǎn)生部分或完全耐藥，或者稱(chēng)之為激素抵抗。雖然這類(lèi)患者只占整個(gè)哮喘群體的5％-10％，但其所花費(fèi)的醫(yī)療資源占據(jù)50％左右。激素抵抗哮喘(steroid resistant asthma，SRA)雖所占比例

7、較低，但其急診就醫(yī)率和住院率分別是輕中度哮喘患者的15倍和20倍，是導(dǎo)致哮喘治療費(fèi)用增加的主要原因之一。通常將誘導(dǎo)痰中的中性粒細(xì)胞達(dá)到一定水平者，稱(chēng)之為中性粒細(xì)胞型哮喘。關(guān)于不同哮喘類(lèi)型的橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，氣道中以嗜酸性粒細(xì)胞聚集為主哮喘患者對(duì)于糖皮質(zhì)激素治療較為敏感;而那些氣道內(nèi)無(wú)嗜酸性粒細(xì)胞，甚至可能表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞增高的患者，往往存在激素治療效果不明顯的情況。因此，探索出有別于的激素的可以有效治療激素不敏感的中性粒細(xì)胞型哮喘的治療方

8、法有重要的臨床意義。
　　第一部分 外源性白介素-17抑制骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化緩解過(guò)敏性氣道炎癥
　　目的：通過(guò)骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化的角度探討外源性IL-17在過(guò)敏性哮喘氣道炎癥發(fā)病過(guò)程中的效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制，同時(shí)探索IL-17對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞存活及功能的影響。
　　方法：野生型C57BL/6小鼠構(gòu)建嗜酸性粒細(xì)胞型哮喘模型，氣道滴注外源性的IL-17或IL-17中和抗體。獲取肺泡盥洗液細(xì)胞，進(jìn)行炎癥細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù);肺組織

9、制備病理切片評(píng)估氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及粘液分泌;ELISA檢測(cè)血清炎癥因子表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)骨髓嗜酸性粒細(xì)胞及其祖細(xì)胞(EoP)水平，并了解IL-17對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的影響;明確IL-17對(duì)骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子或趨化因子受體表達(dá)的影響。體外誘導(dǎo)骨髓嗜酸性粒細(xì)胞分化并以IL-17干預(yù)，檢測(cè)其分化程度、凋亡水平以及分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。
　　結(jié)果：哮喘小鼠氣道滴注外源性IL-17之后，氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，骨髓

10、嗜酸性粒細(xì)胞分化被抑制，其祖細(xì)胞(EoP)形成減少，但是嗜酸性粒細(xì)胞的凋亡未被影響。骨髓細(xì)胞體外誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞分化過(guò)程被IL-17抑制，存活水平無(wú)變化。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中，IL-17下調(diào)了嗜酸性粒細(xì)胞分化相關(guān)的GATA-1、GATA-2及CCR3表達(dá)，而不是與該類(lèi)細(xì)胞分化相關(guān)的細(xì)胞因子IL-3、IL-5、GM-CSF。IL-17亦未能影響嗜酸性粒細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能。哮喘小鼠氣道滴注IL-17中和抗體之后氣道中的嗜酸性粒細(xì)胞募集增加。

11、
　　結(jié)論：本部分研究首次證明外源性IL-17緩解哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性可能是通過(guò)對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞分化的抑制，減少了EoP的形成，進(jìn)而緩解了炎癥部位該類(lèi)細(xì)胞的聚集，而不是通過(guò)對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞的存活或者分泌細(xì)胞因子功能的影響。本研究也因此強(qiáng)調(diào)了在過(guò)敏性氣道炎癥中針對(duì)于嗜酸性粒細(xì)胞的分化抑制可以作為哮喘治療的新的研究方向或策略。
　　第二部分 IL-17通過(guò)ROS介導(dǎo)的TGF-β1表達(dá)促進(jìn)慢性氣道炎癥EMT過(guò)程
　　

12、目的：探索過(guò)敏性氣道炎癥中IL-17對(duì)于氣道上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)過(guò)程的影響極其相關(guān)機(jī)制，對(duì)哮喘的發(fā)病以及進(jìn)一步的有效治療提供理論依據(jù)。
　　方法：利用野生型與IL-17A(IL-17)敲除小鼠構(gòu)建慢性氣道炎癥模型。獲取肺泡盥洗液細(xì)胞，進(jìn)行炎癥細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)，肺組織制備病理切片評(píng)估氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及粘液分泌;免疫組化檢測(cè)肺組織EMT相關(guān)蛋白以及氧化應(yīng)激相

13、關(guān)蛋白8-OHdG的表達(dá);ELISA檢測(cè)肺組織IL-17及TGF-β1表達(dá)并分析其相關(guān)性。人支氣管上皮(HBE)細(xì)胞培養(yǎng)并以IL-17干預(yù)，免疫熒光及Q-PCR檢測(cè)EMT標(biāo)志α-SMA與N-Cadherin表達(dá)，F(xiàn)ACS檢測(cè)IL-17誘導(dǎo)的ROS水平;通過(guò)ROS抑制劑及TGF-β1抑制劑應(yīng)用明確IL-17、ROS及TGF-β1三者在EMT過(guò)程中的關(guān)系。
　　結(jié)果：IL-17缺失的哮喘小鼠與野生型哮喘小鼠相比，氣道炎癥、粘液分泌、膠

14、原沉積、EMT相關(guān)標(biāo)志物（α-SMA、N-Cadherin）、氧化應(yīng)激(8-OHdG)表達(dá)得到緩解;肺組織IL-17與氣道重構(gòu)或EMT相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞因子TGF-β1表達(dá)正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中，IL-17誘導(dǎo)HBE細(xì)胞表達(dá)α-SMA、N-Cadherin與TGF-β1，同時(shí)上調(diào)氧化應(yīng)激ROS形成;TGF-β1抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)IL-17誘導(dǎo)的α-SMA、N-Cadherin表達(dá)，而ROS抑制劑則同時(shí)會(huì)逆轉(zhuǎn)IL-17誘導(dǎo)的α-SMA、N-Cadhe

15、rin及TGF-β1表達(dá)。
　　結(jié)論：IL-17缺失的哮喘小鼠氣道炎癥及EMT過(guò)程緩解，IL-17通過(guò)誘導(dǎo)ROS的過(guò)量產(chǎn)生，進(jìn)而上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，最終促進(jìn)慢性氣道炎癥中EMT的進(jìn)展。
　　第三部分 Bcl-2抑制劑靶向誘導(dǎo)粒細(xì)胞凋亡緩解激素不敏感型氣道炎癥
　　目的：研究氣道炎癥持續(xù)性存在的潛在機(jī)制，并探索出一種有別于激素的能夠通過(guò)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡而緩解氣道炎癥，特別是激素治療抵抗的中性粒細(xì)胞型氣道炎癥的治療策略

16、。
　　方法：構(gòu)建嗜酸性粒細(xì)胞型及中性粒細(xì)胞型哮喘小鼠模型，收集肺泡盥洗液細(xì)胞培養(yǎng)，F(xiàn)ACS檢測(cè)激素或Bcl-2抑制劑ABT-737或ABT-199對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞體外凋亡的影響。免疫組化及免疫熒光檢測(cè)哮喘小鼠肺組織及泡盥洗液炎癥細(xì)胞上Bcl-2表達(dá)水平。野生型及Bcl-2過(guò)表達(dá)小鼠構(gòu)建哮喘模型，通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)氣道炎癥細(xì)胞募集、炎癥因子表達(dá)以及氣道高反應(yīng)性的檢測(cè)，明確Bcl-2在炎癥細(xì)胞存活和清除過(guò)程中的作用。

17、　　結(jié)果：激素在體內(nèi)或體外均可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的凋亡，而表現(xiàn)出對(duì)中性粒細(xì)胞的無(wú)效。氣道炎癥疾病中，炎癥細(xì)胞不但在氣道中募集增加，而且存活時(shí)間延長(zhǎng)。氣道炎癥模型小鼠肺組織以及泡盥洗液粒細(xì)胞上的凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)增加;Bcl-2過(guò)表達(dá)小鼠哮喘模型氣道炎癥更為嚴(yán)重而且持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)。Bcl-2的抑制劑ABT-737或ABT-199給予上述兩種哮喘模型小鼠氣道滴注給藥之后，兩種哮喘模型小鼠均表現(xiàn)出氣道高反應(yīng)性下降，氣道炎癥細(xì)胞募集減少，嗜