ALEX1在乳腺癌中的作用及其機制研究.pdf

1、ALEX/ARMCX（ Arm proteins lost in epithelial cancers on chromosome X）蛋白是Arm蛋白家族的成員之一，因只具有一或二個Arm repeat結構，不同于經典Arm蛋白具有的6-13個Arm repeat結構，而被單獨列為ALEX蛋白家族。其家族成員包括ALEX1、ALEX2和ALEX3?；虮磉_分析顯示ALEX1 mRNA在人類多種正常組織中高表達而在上皮組織來源的癌組織低

2、表達或不表達。ALEX1基因受CREB和Wnt/β-catenin通路調節(jié)并能夠抑制人直腸癌細胞的克隆形成。這些研究表明ALEX1很可能在上皮來源的腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。目前，ALEX1在乳腺癌中的表達及其作用和機制仍不清楚，故本論文主要研究ALEX1在乳腺癌組織標本中的表達水平及對乳腺癌細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡和侵襲轉移等方面的影響及其分子機制。
　　第一部分：ALEX1在乳腺標本中的表達分析
　　目的：檢測乳腺癌組織及

3、對應癌旁組織中的ALEX1表達水平，比較兩者之間的表達是否存在差異，明確ALEX1與臨床病理特征是否具有相關性。
　　方法：應用real-time PCR、免疫組化及western blot方法檢測乳腺癌組織及其對應的癌旁組織中ALEX1 mRNA和蛋白表達水平，統(tǒng)計分析免疫組化檢測的ALEX1的表達量與病人年齡、腫瘤大小、腫瘤病理分級、臨床分期、淋巴結轉移和分子分型之間的關系。
　　結果:對62對乳腺癌及對應癌旁臨床組織標

4、本進行免疫組化染色，結果顯示：ALEX1表達主要定位于胞漿。統(tǒng)計分析表明：乳腺癌組織ALEX1蛋白的表達水平低于乳腺癌旁組織中的表達（p<0.01)；進一步對ALEX1的染色評分與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關系進行分析，發(fā)現乳腺癌中ALEX1的表達與病理分級（1 vs.3，p=0.026；2 vs.3，p=0.045），臨床分期（I vs. III，p=0.008；II vs. III，p=0.011），淋巴結轉移（p=0.03）和分

5、子分型（Luminal A型vs. HER-2過表達型，p=0.02）有關，而與病人年齡、腫瘤大小和腫瘤類型無關（p>0.05）。此外，隨機抽取30對乳腺癌與癌旁組織利用real-time PCR進行檢測，發(fā)現20例乳腺癌組織中ALEX1 mRNA的表達明顯低于對應的癌旁組織中的表達（p<0.01）；隨機抽取6對乳腺癌與癌旁組織采用western blot對ALEX1蛋白進行檢測，結果顯示：乳腺癌組織ALEX1蛋白表達水平均低于對應的癌

6、旁組織中的蛋白表達。
　　結論：本研究發(fā)現ALEX1在乳腺癌組織中的表達明顯低于相應的癌旁組織，乳腺癌的病理分級、臨床分期越高，ALEX1的表達水平越低；在有淋巴結轉移的乳腺癌組織中ALEX1表達水平明顯低于無淋巴結轉移的乳腺癌組織，而且在乳腺癌的分子分型中乳腺癌HER-2過表達型組織中ALEX1的表達水平低于Luminal A型。
　　第二部分：ALEX1對乳腺癌細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響
　　目的：研究過表達/

7、沉默ALEX1對乳腺癌細胞SK-BR3/MCF-7增殖、周期和凋亡的影響。
　　方法：Real-time PCR和western blot方法檢測ALEX1在正常乳腺細胞MCF-10A和乳腺癌細胞MCF-7、T47D、SK-BR3、MDA-MB-231中表達情況，免疫熒光細胞化學技術檢測ALEX1亞細胞定位。過表達ALEX1慢病毒感染乳腺癌細胞SK-BR3后，熒光顯微鏡觀察重組慢病毒LV5-ALEX1的感染效率，real-time

8、 PCR和western blot方法檢測ALEX1 mRNA和蛋白表達水平。利用合成的三條RNAi序列瞬時轉染MCF-7后，用real-time PCR和western blot方法檢測ALEX1 mRNA和蛋白表達情況。過表達/沉默ALEX1后CCK8（Cell Counting Kit）檢測細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞周期和凋亡情況。
　　結果：Real-time PCR和western blot結果顯示：在乳腺癌各細胞

9、株中ALEX1的表達水平均低于正常乳腺細胞MCF-10A，但ALEX1在MCF-7細胞株中表達水平高于其他乳腺癌細胞株，在SK-BR3中表達水平最低且ALEX1蛋白定位于胞漿中。過表達ALEX1慢病毒感染乳腺癌細胞SK-BR372h后，熒光顯微鏡觀察感染效率達90％以上；與對照組LV5-NC（LV5-Negative Control）相比，實驗組LV5-ALEX1中ALEX1 mRNA和蛋白的表達明顯增高。CCK8結果顯示：LV5-AL

10、EX1組感染LV5-ALEX1慢病毒48h到96h SK-BR3細胞生長明顯受到抑制（p<0.05）。Hoechst染色和流式細胞術結果顯示LV5-ALEX1組凋亡細胞數量多于LV5-NC（p<0.05）。利用小RNA干擾技術瞬時轉染MCF-7細胞48h后，real-time PCR和western blot結果顯示三條RNAi序列中其中RNAi-2序列沉默ALEX1效果明顯，選擇作為后續(xù)實驗。實驗分兩組：實驗組SiALEX1和陰性對照

11、組SiCon。CCK8結果顯示：轉染SiALEX148 h到96h，MCF-7細胞生長強于陰性對照組SiCon（p<0.05）。Hoechst染色和流式細胞術結果顯示：MCF-7細胞中SiALEX1組的凋亡細胞數量少于SiCon組（p<0.05）。流式細胞儀檢測細胞周期分布結果顯示：過表達/沉默ALEX1對乳腺癌細胞周期變化均沒有影響。
　　結論：過表達ALEX1抑制乳腺癌SK-BR3細胞的增殖，誘導細胞凋亡；沉默ALEX1促進乳

12、腺癌MCF-7細胞的增殖，抑制細胞凋亡。
　　第三部分：ALEX1誘導乳腺癌細胞凋亡的機制
　　目的：深入研究ALEX1誘導乳腺癌細胞凋亡的分子機制。
　　方法：Western blot方法檢測過表達/沉默ALEX1乳腺癌細胞中凋亡相關蛋白的表達情況。利用生物信息學方法預測調控ALEX1的miRNAs。Western blot方法和雙熒光素酶報告實驗驗證miR-590-5p調控ALEX1。然后分別以MCF-7和SK-B

13、R3乳腺癌細胞為實驗模型，在MCF-7細胞中將實驗分為NC mimics組和miR-590-5P mimics組；SK-BR3細胞中分為NC inhibitor組和miR-590-5P inhibitor組，利用western blot方法檢測ALEX1及凋亡相關蛋白表達情況。接下來，我們利用“功能回復實驗”在MCF-7細胞中將實驗分為NC mimics+GV230-NC組、GV230-NC+miR-590-5P mimics組、 NC

14、 mimics+GV230-ALEX1和miR-590-5P mimics+GV230-ALEX1組；在SK-BR3細胞中分為NC inhibitor+SiCon組、SiCon+miR-590-5P inhibitor組、NC inhibitor+SiALEX1和miR-590-5P inhibitor+SiALEX1組，進一步明確ALEX1受miR-590-5P調控誘導乳腺癌細胞凋亡。
　　結果：Western blot結果顯示

15、：SK-BR3細胞中過表達ALEX1后，上調Bax、active caspase9和active caspase3蛋白表達，下調Bcl-2蛋白表達。MCF-7細胞中沉默ALEX1后，下調Bax、active caspase9和active caspase3蛋白表達，上調Bcl-2蛋白表達。Western blot方法和雙熒光素酶報告實驗驗證結果顯示：miR-590-5p與ALEX13'-UTR結合調控ALEX1mRNA和蛋白水平的表達。

16、在MCF-7細胞中與NC mimics組相比，miR-590-5p mimics組中，ALEX1、Bax、active caspase9和active caspase3蛋白表達下調，Bcl-2蛋白表達上調。SK-BR3細胞中miR-590-5P inhibitor組與NC inhibitor對照組相比，ALEX1、Bax、active caspase9和active caspase3蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調。功能回復實驗中顯

17、示外源性補充/沉默ALEX1能夠逆轉上述各凋亡蛋白的表達水平。
　　結論：過表達ALEX1通過內源性凋亡通路誘導SK-BR3細胞凋亡；沉默ALEX1通過內源性凋亡通路抑制MCF-7細胞凋亡。ALEX1是miR-590-5P新的靶基因。ALEX1受miR-590-5P調控通過內源性凋亡通路誘導乳腺癌細胞發(fā)生凋亡。
　　第四部分：ALEX1在乳腺癌細胞上皮間質轉化中作用機制的初探
　　目的：初步探明ALEX1在乳腺癌細胞上

18、皮間質轉化過程中的作用機制。
　　方法：在乳腺癌細胞MDA-MB-231/MCF-7中過表達/沉默ALEX1后，顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化；細胞劃痕愈合和Transwell實驗檢測乳腺癌細胞遷移侵襲能力；western blot檢測上皮間質標志物的表達情況。
　　結果：乳腺癌MDA-MB-231細胞中過表達ALEX1后，細胞形態(tài)由長梭形變?yōu)槎噙呅?；細胞劃痕實驗結果顯示：實驗組遷移距離明顯小于LV5-NC對照組；Transwell

19、結果顯示：細胞穿膜數量明顯少于對照組；western blot結果顯示：實驗組中間質類型標志物N-cadherin和Vimentin的表達消失，Snail-1、Slug未見明顯變化，Twist表達水平降低；上皮類型標志物E-cadherin的表達水平升高。乳腺癌MCF-7細胞中沉默ALEX1后，細胞形態(tài)由扁圓形變?yōu)樯斐鰝巫愕亩噙呅?；細胞劃痕愈合實驗結果顯示：實驗組遷移距離明顯大于SiCon對照組；Transwell結果顯示：細胞穿膜數量

20、明顯多于對照組，western blot結果顯示：實驗組中上皮類型標志物E-cadherin的表達消失，間質類型標志物N-cadherin、Vimentin和Twist表達水平升高，Snail-1和Slug表達未見明顯變化。
　　結論：過表達ALEX1能夠減弱MDA-MB-231侵襲遷移能力，誘導MDA-MB-231由間質細胞向上皮細胞轉化；沉默ALEX1能夠增強MCF-7侵襲遷移能力，誘導MCF-7由上皮細胞向間質細胞轉化。我們