結直腸癌臨床血清標志物早期輔助診斷模型及初級凋亡基因調控網(wǎng)絡的探討.pdf

1、研究背景：
　　結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來隨著人們飲食結構和飲食習慣的改變、生活水平質量的提高，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，約有1/3結直腸癌患者就診時已屬晚期，相對生存率低于40％，很大程度上延誤了治療。因此，尋找用于早期診斷結直腸癌的特異性標志物對提高患者生存率和生活質量具有重要意義。
　　研究目的：
　　本研究旨在篩選可用于結直腸癌早期診斷的生物標

2、志物，建立結直腸癌早期血清診斷模型及并初步探討結直腸癌基因凋亡調控網(wǎng)絡模型，為臨床上結直腸癌早期診斷、靶向治療結直腸癌提供一定的理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　1.以CNKI、維普、萬方數(shù)據(jù)庫、PubMed和MEDLINE數(shù)據(jù)庫為文獻檢索的主要來源，中文檢索詞為“結直腸癌”，“血清腫瘤標志物”，“基因標志物”，“早期診斷”，英文檢索詞為“colorectal cancer”，“serum tumor markers”，“g

3、ene markers”，“early diagnosis”，搜集1990年1月1日至2013年12月31日國內外公開發(fā)表的關于結直腸癌早期診斷的血清標志物和基因標志物的相關研究文獻，納入研究，提取有效數(shù)據(jù)，并對納入文獻進行評估，然后利用Meta-Disc軟件進行診斷性試驗Meta分析。
　　2.收集2013年1月至2013年12月到鄭州大學第一附屬醫(yī)院消化科就診的結直腸癌手術治療患者100例，其中男56例，女44例，年齡25～8

4、2歲，中位年齡為59.0歲。同期收集在本科室住院非結直腸癌患者50例作為良性對照組，其中男21例，女29例，年齡為32～80歲，中位年齡52.5歲。上述全部病例診斷均經(jīng)過臨床、內鏡及病理學證實。所有受試者均簽署知情同意書。采用酶聯(lián)免疫法檢測實驗組和對照組患者血清中經(jīng)Meta分析篩選出的CEA、CA50、HSP60、CYFRA21-1、TPA、AFP、CA199、CA242、CA724、CA125、CA153、UGT1A8等12種血清標志

5、物水平，然后采用Logistic回歸分析和支持向量機（Battacharyya-SVM）兩種方法分別建立結直腸癌早期診斷模型。
　　3.利用基因本體數(shù)據(jù)庫（GO）和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）對第一部分經(jīng)Meta分析篩選出的WWOX、K-ras、COX-2、p53、APC、DCC和PTEN等七種基因標志物進行GO功能分析和KEGG信號通路分析，初步建立結直腸癌初級凋亡調控網(wǎng)絡模型。而WWOX是一種新發(fā)現(xiàn)的結直腸癌抑癌

6、因子， WWOX參與的凋亡信號通路尚不清楚，因此利用 RT-PCR、TUNEL法檢測WWOX基因對凋亡調控網(wǎng)絡中相關節(jié)點表達水平及對結直腸癌Colo205細胞系凋亡的影響，驗證WWOX基因參與的凋亡信號通路。
　　研究結果：
　　1、結直腸癌早期診斷生物標志物的Meta分析
　　血清標志物診斷性試驗 Meta分析結果顯示：納入本次 Meta分析的文獻共64篇。CEA、CA242、HSP60、CA724、CA199、CA

7、125、CA50、CYFRA21-1、AFP、CA153、TPA及UGT1A8等12種血清腫瘤標志物的診斷比值比（Diagnostic OR, DOR）分別為7.37(5.90,9.22)、7.15(5.17,9.90)、6.72(1.93,23.45)、6.64(4.47,9.84)、4.80(3.67,6.27)、3.65(1.60,8.36)、3.41(2.09,5.59)、3.19(2.21,4.60)、1.16(0.14,9.

8、82)、1.36(0.73,2.53)、3.21（1.35,7.64）及45.5（11.12,186.24），P值均小于0.01，結果表明12種血清標志物對結直腸癌均有一定的診斷效能。
　　基因標志物診斷性試驗 Meta分析結果顯示：納入本次 Meta分析的文獻共44篇。WWOX、K-ras、COX-2、p53、APC、DCC和PTEN等7種基因標志物的診斷比值比分別為7.56(4.97,11.50)、12.56(6.33,24.

9、90)、10.29(4.00,26.45)、17.42(9.30,32.62)、25.40(7.37,87.50)、54.41(11.28,262.54)和22.39(10.69,46.88)， P值均小于0.01，結果表明七種基因標志物對結直腸癌的診斷效能均較高，其中以DCC基因的診斷效能最高。
　　2、結直腸癌血清腫瘤標志物早期診斷模型的建立
　　采用Logistic回歸分析結果顯示，最終納入回歸方程的自變量有3項，分別

10、為CEA、CA199和HSP60，將CEA、CA199、HSP60和Logistic回歸模型進行受試者工作特征曲線(ROC)分析，結果表明CEA、CA199、HSP60單獨檢測及Logistic回歸模型對結直腸癌診斷的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.762、0.752、0.825和0.906，P值均小于0.01，該模型的診斷準確率為82.67%，Logistic回歸模型的診斷價值優(yōu)于任一單項指標。分別采用12個血清標志物、巴氏距離超

11、過2的七個血清標志物及巴氏距離超過3的四個血清標志物建立了三個SVM診斷模型，分類準確率分別為73.33%、86.67%和80%，以采用CEA、CA50、CYFRA21-1、CA199、CA724、CA125、UGT1A8等7個指標聯(lián)合建立SVM診斷模型的分類準確率最高。
　　3、結直腸癌基因標志物凋亡調控網(wǎng)絡模型的初步建立
　　結合GO功能分析和KEGG信號通路分析結果，初步建立了由p53、APC、DCC、K-ras、PT

12、EN、WWOX及COX-2七個基因標志物及其他相關基因組成的結直腸癌初級凋亡調控網(wǎng)絡模型。WWOX基因轉染 Colo205細胞后， pcDNA4.0/Myc-WWOX轉染組、pcDNA4.0/Myc-His空載體轉染組以及Colo205細胞對照組三組細胞的凋亡率分別為(12.63±0.43)%、(2.31±0.58)%、(2.20±0.36)%，提示 pcDNA4.0/Myc-WWOX的轉染能夠使 Colo205細胞系的凋亡率升高，且轉

13、染細胞 Colo205中 WWOX基因的 mRNA表達水平均高于pcDNA4.0/Myc-His空載體轉染組以及Colo205細胞對照組。Colo205腫瘤細胞中野生型p53 mRNA表達水平較低，而轉染質粒pcDNA4.0/Myc-WWOX后，轉染細胞Colo205中野生型p53 mRNA表達水平高于pcDNA4.0/Myc-His空載體轉染組以及Colo205細胞對照組，提示W(wǎng)WOX基因能夠上調p53基因的表達水平。WWOX是通過激

14、活p53信號通路，參與結直腸癌凋亡信號通路。
　　結論：
　　1.篩選出了對結直腸癌具有一定診斷效能的CEA、CA242、HSP60、CA724、CA199、CA125、CA50、CYFRA21-1、AFP、CA153、UGT1A8及TPA12種血清標志物以及WWOX、K-ras、COX-2、p53、APC、DCC和PTEN7種基因標志物。
　　2.建立了 CEA、CA50、CYFRA21-1、CA199、CA724、