魚類TLR1和DIGIRR基因的克隆和表達(dá)研究.pdf

1、TLR-IL-1R(TIR)超家族成員在介導(dǎo)免疫反應(yīng)中具有非常重要的作用，其共同特點(diǎn)是胞內(nèi)區(qū)都含有一個(gè)TIR保守結(jié)構(gòu)域。TIR超家族主要分為兩個(gè)亞群：一個(gè)亞群是胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)的受體，即Toll樣受體亞家族；另一個(gè)是胞外區(qū)含有免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域的受體，即IL-1受體亞家族；第三個(gè)亞群由信號(hào)通路下游接頭分子組成，即MyD88亞家族。TLR1和SIGRR都是。TIR超家族的成員，分別屬于TIR家族的Toll樣受體亞家

2、族和IL-1受體亞家族。TLR1是TLR家族的重要成員之一，屬于病原相關(guān)分子模式(PAMP)識(shí)別受體，TLR1可與TLR2形成異源二聚體從而識(shí)別三?；暮驼婢囊恍┊a(chǎn)物。DIGIRR是哺乳動(dòng)物SIGIRR的同源體，是TIR超家族中新發(fā)現(xiàn)的成員，屬于孤兒受體，目前認(rèn)為SIGIRR主要在TIR超家族成員信號(hào)通路中起負(fù)調(diào)控作用。本研究在河豚中成功克隆了2個(gè)新基因，TLR1基因(TnTLR1)和DIGIRR基因(TnDIGIRR)。

3、TnTLR1 cDNA序列長2587bp，其中5’URT長122bp，3’UTR長74bp，ORF長2391bp。TnTLR1基因編碼由796個(gè)氨基酸組成、分子量為90．69kDa、p，為8．43的多肽。在TnTLR1多肽序列上存在多個(gè)潛在活性位點(diǎn)，包括13個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，9個(gè)N端糖基化位點(diǎn)，1個(gè)細(xì)胞黏附序列，3個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，13個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)十四?；稽c(diǎn)。TnTLR1具有LRR結(jié)構(gòu)域受體亞家族的共同

4、特征，胞外區(qū)582個(gè)氨基酸，包括5個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域；胞內(nèi)區(qū)157個(gè)氨基酸，具有典型的TLR結(jié)構(gòu)域；此外，還具有57個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)和長23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列。TnTLR1在正常組織中為組成性表達(dá)，LPS誘導(dǎo)并不能顯著改變TnTLR1在這些組織中的表達(dá)量。序列比對(duì)顯示TnTLR1與其它物種TLR1s之間有較高的氨基酸相似性，說明TLR1s在進(jìn)化中具有高度的保守性。進(jìn)化樹分析表明魚類TLR1s基因很有可能是哺乳動(dòng)物TLR1、TLR6和TLR

5、10基因在進(jìn)化過程中的共同祖先，為研究魚類TLR1s在進(jìn)化和免疫反應(yīng)中的作用打下了基礎(chǔ)。 TnDGIRR cDNA序列長1916bp，其中5’UTR長112bp，3’UTR長229bp，ORF長1575bp?！疶nDIGIRR基因編碼由524個(gè)氨基酸組成、分子量為58．05kDa、P<'I>為6．54的多肽。在TnDIGIRR多肽序列上的潛在活性位點(diǎn)包括6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，7個(gè)N端糖基化位點(diǎn)，8個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，5

6、個(gè)十四?；稽c(diǎn)。TnDIGIRR同樣具有Ig結(jié)構(gòu)域受體亞家族的共同特征，胞外區(qū)236個(gè)氨基酸，包括兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域；胞內(nèi)區(qū)272個(gè)氨基酸，具有典型的TIR結(jié)構(gòu)域；此外，還具有16個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)和長16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列。TnDIGIRR在健康魚所選組織中為非組成性表達(dá)，心臟、腦、皮膚和肝臟表達(dá)量較高，鰓和腸組織中表達(dá)量稍低，而在肌肉中不表達(dá)。基因結(jié)構(gòu)分析、多序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析都表明，魚類DIGIRR有其特殊性，主要表現(xiàn)在胞外區(qū)帶有