兔卵母細胞為受體的同種和異種體細胞核移植研究.pdf

1、本研究的主要目的是通過建立體細胞核移植(SENT)方法，在體外條件下獲得兔一兔同種或人一兔異種克隆囊胚，為以后從克隆囊胚的內(nèi)細胞團分離培養(yǎng)出全能性的胚胎干細胞并用于治療性克隆等研究提供實驗依據(jù)和方法。本研究從重構(gòu)胚的激活、受體卵母細胞的來源、克隆胚胎的體外培養(yǎng)及兔卵丘細胞和骨髓基質(zhì)細胞(rBMSCs)用作核供體等幾個方面進行了較為系統(tǒng)的研究以提高SCNT的效率。此外，利用人骨髓基質(zhì)細胞(hBMSCs)用作核供體進行了人—兔異種克隆的初步

2、探索并獲得了異種克隆囊胚。主要內(nèi)容如下： 為了提高兔體細胞核移植(SCNT)胚胎的體外發(fā)育效果，通過不同激活劑采用不同聯(lián)合處理對兔SCNT的重構(gòu)胚進行激活，以遴選出適合于本實驗室條件下較為理想的激活方案，結(jié)果表明：兔SCNT重構(gòu)胚先用5 μM ION避光處理4min，洗滌后再移入含2mM 6-DMAP和7.5μg/ml CB的mM-199(添加有10％FBS的TCM-199)中培養(yǎng)3h的激活效果較為理想，獲得了73.3％的分裂率

3、以及22.2％的囊胚率。雖然采用的激活方法與胚胎體外培養(yǎng)液各不相同，但改進的激活方法獲得的實驗結(jié)果達到國內(nèi)外已有兔SCNT報道的相同水平。 為了降低實驗成本，獲取更多的卵母細胞州丁SCNT，本研究國內(nèi)外首次采用抽吸自PMSG或FSH超排母兔排卵結(jié)束(HCG注射14h)后卵巢表面殘留卵泡內(nèi)的卵母細胞用于SCNT研究，并同時與排出到輸卵管內(nèi)的卵母細胞進行比較。結(jié)果表明：PMSG和FSH超排獲得的抽吸組成熟卵母細胞(以可見第一極體為準

4、)的比率分別極顯著和顯著低于各自的排出組(PMSG：70.7％vs94.6％，P<0.01；FSH：81.5％vs 94.6％，P<0.05)，且PMSG和FSH抽吸組問卵母細胞的成熟率差異顯著(70.7％vs 81.5％，P<0.05)。PMSG和HCG超排的抽吸組成熟卵母細胞的去核效率也顯著低于各自的排出組(PMSG：抽吸vs排出=69.2％vs 83.6％，P<0.05；FSH：抽吸vs排出=71.6％vs81.0％，P<0.05

5、)。抽吸組成熟卵母細胞的注核效率以及此類卵母細胞用作胞質(zhì)受體經(jīng)體細胞移植后的重構(gòu)胚在融合率、分裂率以及分裂胚胎發(fā)育至囊胚的比例與排出組差異均不顯著(JP>0.05)。但是，PMSG超排后的抽吸組成熟卵母細胞體細胞核移植的總體效率顯著低于其排出組(8.4％vs11.5％，P<0.05)，而FSH超排的結(jié)果抽吸組與排出組差異則不顯著(10.2％vs 11.6％，P>O.05)。結(jié)果顯示：抽吸白超排兔卵巢表面卵泡內(nèi)的卵母細胞人多數(shù)都已經(jīng)成熟，

6、獲得的重構(gòu)胚與源自排出劍輸卵管內(nèi)的卵母細胞的重構(gòu)胚具有等同的發(fā)育能力，可以不經(jīng)體外成熟培養(yǎng)而直接用于體細胞核移植，而且FSH超排獲得的抽吸組卵母細胞體細胞核移植的總體效率與排出到輸卵管內(nèi)的卵母細胞沒有顯著差別。 為了提高兔SCNT胚胎體外發(fā)育至囊胚階段的比例，首次在體外培養(yǎng)階段添加不同濃度(O、10和20gM)的β-巰基乙醇(β-ME)米檢測β-ME的添加對兔孤雌生殖和體細胞核移植胚胎體外發(fā)育能力和囊胚質(zhì)量的影響。結(jié)果顯示：在m

7、M-199添加10μM β-ME后顯著提高了孤雌生殖和SCNT胚胎的分裂率以及胚胎各階段的發(fā)育能力(p<0.05)。通過對孤雌生殖胚胎首先在10uM的B．ME中培養(yǎng)12小時后，分裂的2～4細胞胚胎再分別用添加0、10、20gM的β-ME體外培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)的研究進一步發(fā)現(xiàn)，β-ME的這種促進作用主要在胚胎開始培養(yǎng)的前12h內(nèi)(≤4細胞階段)起作本研究選擇具有臨床應用價值的骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)為核供體進行核移植，建立了兔SCNT的方法

8、，重構(gòu)胚的分裂率為65.2％，分裂后胚胎發(fā)育至囊胚階段的比例為26.7％，獲得的囊胚有62.5％進入孵化階段；孵化出來的細胞貼壁生長并向周圍擴展，顯示了具有向下一階段發(fā)育的潛能。實驗結(jié)果表明以兔成體體細胞的骨髓基質(zhì)細胞為核供體，經(jīng)克隆技術(shù)生產(chǎn)出囊胚并從中分離內(nèi)細胞團細胞具有可行性，為進一步從囊胚內(nèi)細胞團細胞中分離并培養(yǎng)出胚胎干細胞提供了克隆源性的囊胚。 在已經(jīng)建立的兔骨髓基質(zhì)細胞(rBMSCs)核移植方法的基礎上，首次探討了利用

9、人骨髓基質(zhì)細胞(hBMSCs)構(gòu)建人—兔異種克隆胚胎的方法，并通過用rBMSCs和兔卵丘細胞用(rCCs)做核供體的同種克隆進行比較，米評估hBMSCs用作核供體的克隆效率。結(jié)果顯示，與用于同種克隆的融合電壓(2.0k V/cm)相比，人—兔異種克隆重構(gòu)胚的融合率很低，但可以通過提高的融合電壓強度(2．4kV/cm)極顯著提高hBMSCs—兔異種克隆重構(gòu)胚的融合率(60.0％vs 39.6％，P

10、重構(gòu)胚相一致的融合率(60.0％vs 62.2％，P>0.05)，而改進的直接注核法也可以提高顯微操作的總體效率(78.4％vs 68.9％，P<0.05)以獲得更多的重構(gòu)胚。雖然，由hBMSC重構(gòu)的人—異種克隆胚胎發(fā)育至囊胚的比例極顯著低于由rCCs和rBMSCs構(gòu)建的同種克隆囊胚，但依舊有少量重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚階段(4.8％～6.1％vs 27.3％和21.4％，P<0.01)。實驗結(jié)果表明，以人骨髓基質(zhì)細胞為核供體，經(jīng)異種克隆技術(shù)可