自噬缺失激活HSF1介導的熱休克反應的分子機制.pdf

1、背景:自噬（autophagy）是真核生物細胞內(nèi)去除破損細胞器和半衰期較長蛋白質(zhì)的一種生理過程，是調(diào)控細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)應激反應之一，在進化上十分保守。自噬根據(jù)發(fā)生過程的不同，可以分為三種：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侶介導的自噬（CMA）。其中最典型的是巨自噬，其主要是通過形成自噬體并與溶酶體融合成自噬溶酶體來降解細胞自身物質(zhì)。自噬的發(fā)生主要由自噬相關基因（ATGs）控制。ATG7是自

2、噬體形成的關鍵調(diào)節(jié)因子，在ATG12和ATG5結(jié)合過程以及LC3的脂化過程中起重要作用，能夠有效的激活自噬，防止錯誤折疊蛋白的累積。在正常生理條件下，自噬負責去除損壞的或無功能的細胞器和蛋白質(zhì)，從而給細胞代謝提供氨基酸和其它必需成分。在應激刺激下（如營養(yǎng)匱乏，氧化應激，有毒化合物，以及病原體的侵入），自噬被激活去除損壞的細胞內(nèi)組分。自噬對于細胞分化和組織重塑必不可少，同時對細胞的生存和死亡發(fā)揮重要作用。
　　熱休克反應是細胞中另外

3、一種重要的保護性機制。熱休克反應（HSR）是生物體和細胞應對各種外界壓力條件，通過激活熱休克轉(zhuǎn)錄因子（HSFs），調(diào)節(jié)熱休克蛋白（HSPs）的表達，從而保持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一種生理過程。已知的熱休克轉(zhuǎn)錄因子有四種：HSF1、HSF2、HSF3和HSF4，其中HSF1是介導熱休克反應的主要轉(zhuǎn)錄因子。在正常生理條件下，熱休克蛋白的表達量很少，只占總蛋白的1-2﹪。在熱激、活性氧過多或炎癥的刺激下，Hsf1被激活后結(jié)合到下游熱休克蛋白基因的啟動子

4、上，促進熱休克蛋白的表達，從而維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。熱休克蛋白根據(jù)分子量不同，可以分成兩類：一類是ATP依賴型的大分子HSPs，如HSP100、HSP90、HSP70和HSP60；一類是不依賴ATP的小分子HSPs，如HSP25和αB-crystallin等。在不同的組織或細胞中，熱休克蛋白的功能具有差異性。有研究表明，HSP70、HSP25和αB-crystallin熱休克蛋白具有抗凋亡的功能。HSP25在亨廷頓氏舞蹈癥的發(fā)生中起重要的

5、保護作用， HSP25的突變可能會導致運動神經(jīng)元的病變。
　　近來發(fā)現(xiàn)應激反應的轉(zhuǎn)錄因子如p53，NF-κB和STAT3在自噬中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。同樣作為轉(zhuǎn)錄因子，HSF1被發(fā)現(xiàn)可以通過直接調(diào)節(jié)ATG7介導自噬來保護腫瘤細胞抵抗化療作用。肺腺癌A549細胞系中過表達的HSP70可以調(diào)節(jié)mTOR/ Akt信號通路從而抑制細胞自噬。然而，小鼠成纖維細胞和小鼠近端腎小管細胞中自噬對HSF1介導的熱休克反應的調(diào)控并不清楚。據(jù)研究報道，自噬

6、的缺失和許多疾病的發(fā)生相關，比如肌肉萎縮、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤的發(fā)生以及衰老等。熱休克反應和自噬均為細胞應對外界環(huán)境壓力的重要保護性機制。通過本課題的研究，我們將深入探討HSF1介導的熱休克反應是否在自噬缺失的細胞中存在代償作用。
　　目的:本課題以敲除ATG7的小鼠成纖維細胞和小鼠近端腎小管細胞為研究對象，探究自噬缺失引發(fā)的HSF1介導的熱休克反應及其分子機制。
　　方法:
　　1.應用NIH3T3的方法建立ATG7

7、F/F轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細胞（MEF/ATG7F/F）和敲除ATG7的小鼠成纖維細胞（MEF/ATG7-/-），并應用免疫印記檢測兩種細胞中的自噬和熱休克反應水平；
　　2.在應激刺激（43℃熱激和MG132處理）處理下，用Real time PCR和免疫印記測定細胞內(nèi)熱休克蛋白的mRNA和蛋白表達水平；
　　3.在不處理和熱休克刺激下進行免疫印記測定小鼠近端腎小管細胞MPTC/ATG7F/F和MPTC/ATG7-/-中的自噬

8、和熱休克反應水平；
　　4.染色質(zhì)免疫沉淀實驗（ChIP）檢測43℃熱激刺激下兩種穩(wěn)定株細胞中HSF1和熱休克蛋白基因啟動子的結(jié)合情況；
　　5.分別用細胞核質(zhì)分離實驗和HSF1的三聚化檢測實驗探究43℃熱激刺激下HSF1轉(zhuǎn)錄活性激活的分子機制；
　　6.分別用EBSS和順鉑（cis-platin）處理兩種細胞，應用免疫印跡方法探究敲除ATG7后高表達的HSP25對自噬缺失細胞的作用。
　　結(jié)果:敲除小鼠成纖維細