谷氨酰胺合成酶對(duì)Escherichia coli和Pseudomonas putida生物膜形成的影響.pdf

1、生物膜（biofilms）是細(xì)菌吸附在有機(jī)或無(wú)機(jī)介質(zhì)上時(shí)，通過(guò)分泌含表面多糖、蛋白、DNA的細(xì)胞外基質(zhì)，將菌群包圍其中所形成的復(fù)合體。在自然界中，細(xì)菌主要以生物膜形態(tài)存在。生物膜結(jié)構(gòu)為內(nèi)部菌群提供了物理性防護(hù)，生物膜中的菌體可形成互養(yǎng)共棲關(guān)系協(xié)同進(jìn)行新陳代謝，遺傳物質(zhì)可橫向轉(zhuǎn)移使得進(jìn)化更快，生物膜的形成對(duì)微生物提供了生態(tài)學(xué)優(yōu)勢(shì)。 生物膜的形成受多種因素影響，外界環(huán)境條件如水文條件、吸附介質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、光照、溫度等，細(xì)菌內(nèi)在的調(diào)節(jié)

2、機(jī)制如密度感應(yīng)系統(tǒng)都可影響生物膜形成。與浮游態(tài)相比細(xì)菌在形成生物膜時(shí)多種基因差異表達(dá)，差異表達(dá)的基因包括細(xì)菌吸附過(guò)程、密度感應(yīng)系統(tǒng)、代謝、應(yīng)答環(huán)境壓力、分子伴侶相關(guān)的基因。 在前期實(shí)驗(yàn)中通過(guò)蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）與浮游態(tài)相比在生物膜形成過(guò)程中有多個(gè)基因差異表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)選取其中一個(gè)差異表達(dá)的蛋白--谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）通過(guò)該基因的

3、過(guò)量表達(dá)、抑制和敲除以研究其對(duì)生物膜形成的影響。 本文用恒流器模擬自然界中流體環(huán)境，以低營(yíng)養(yǎng)的Hutner鹽液為培養(yǎng)基，以載玻片為吸附介質(zhì)培養(yǎng) Pseudomonas putida和 Escherichia coli，培養(yǎng)溫度30℃，儲(chǔ)液罐進(jìn)液流速15mL/h，空氣進(jìn)入速度14-16mL/s，使其在載玻片上形成生物膜。通過(guò)顯微鏡觀察生物膜形成過(guò)程。P．putida培養(yǎng)時(shí)間0-60h時(shí)為粘附聚集階段，60-84h為微菌落形成階段，

4、84h后為生物膜成熟階段。E．coli培養(yǎng)時(shí)間為0-72h時(shí)為粘附聚集階段，72-96h為微菌落形成階段，96h后為生物膜成熟階段。 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得E．coli gln gene全長(zhǎng)序列。利用PCR擴(kuò)增出谷氨酰胺合成酶基因，將gln與質(zhì)粒pBC KS+連接構(gòu)建出gln gene表達(dá)載體pBC KS-glnhb，并進(jìn)行表達(dá)。利用恒流器培養(yǎng)E．coli-pBC KS-glnhb形成生物膜，觀察其生物膜形成狀況。與E．coli同期

5、相比谷氨酰胺合成酶過(guò)量表達(dá)的菌體生物膜形成能力較弱，菌群的密度和厚度均有減少，谷氨酰胺合成酶的過(guò)量表達(dá)對(duì)生物膜形成有較大影響。 利用反義RNA與gln gene的mRNA互補(bǔ)結(jié)合后可干擾gln gene正常表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)將E．coli gln gene的反義鏈連接入質(zhì)粒，構(gòu)建出反義核酸載體pBCKS-glnbh，并轉(zhuǎn)入E．coli DH5α，轉(zhuǎn)化后的重組子可用于利用RNA干擾檢測(cè)谷氨酰胺合成酶不同表達(dá)對(duì)生物膜形成的影響。同時(shí)構(gòu)建出