哺乳動物sterile twenty 20-like激酶3（mst3）在小鼠胚胎的表達及其相關(guān)機制的初步研究.pdf

1、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘?nèi)部的重要傳遞者。近年來，絲裂原活化蛋白激酶的研究，使人們對蛋白質(zhì)磷酸化在信號轉(zhuǎn)導中的作用有了進一步的認識。多種細胞生理過程，如生長、發(fā)育、分裂、死亡以及細胞間的功能同步化等都涉及到MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)。從單細胞酵母到人類都保留了保守的MAPK激酶級聯(lián)通路，即MAPKKK(MAPkinasekinasekinase)→MAPKK(MAPkinasekinase)→MAPK(

2、MAPkinase)。外界因素刺激引起MAPKKK磷酸化激活，然后MAPKKK磷酸化激活MAPKK，繼而激活MAPK。 STE20是釀酒酵母的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，位于MAPK級聯(lián)通路的上游。該家族包括PAK和SPS1兩個亞族。mst3是哺乳動物STE20絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，1997年首次從hela細胞cDNA文庫中分離出來，屬于SPS1亞族，包含一個N端催化功能區(qū)和一個C端調(diào)節(jié)功能區(qū)。目前已知caspase酶切

3、激活mst3后促進細胞凋亡，但其他生理機能是未知的。本研究對mst3在小鼠胚胎發(fā)育過程中的表達及其作用機制進行探索性研究，為今后的研究奠定理論基礎和實驗依掘，具體內(nèi)容包括： 一、mst3-pCMV-tag3c重組質(zhì)粒的構(gòu)建和mst3碳端抗體特異性的檢測鑒定用EcoRI和ApaI限制性內(nèi)切酶從mst3-pCDNA3.0'上切取1230bp的mst3cDNA片斷。按pCMV-tag3c載體的多克隆位點用EcoRI和ApaI限制性內(nèi)

4、切酶切開pCMV-tag3c載體。pCMV-tag3c和mst3的酶切片斷16℃經(jīng)T4連接酶作用形成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA，通過限制性酶切進行鑒定并進行核苷酸序列測定。結(jié)果表明：成功克隆到mst3全編碼基因片斷，序列與GenBank中收錄的mst3cDNA序列一致。mst3-pCMV-tag3c重組質(zhì)粒在LipofectAMINETM2000脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞293T，通過免疫熒光共定位

5、方法鑒定mst3碳端抗體的特異性。 二、mst3特異性在小鼠胚胎骨骼肌組織表達，表達具有時空差異性利用光鏡免疫組織化學方法對小鼠胚胎發(fā)育過程中mst3的組織表達進行實驗觀察，結(jié)果表明：1.mst3在小鼠胚胎發(fā)育過程中的組織分布非常特異：特異地在胚胎的骨骼肌組織表達。2.mst3在骨骼肌的表達存在一定的時空差異性。mst3在胚胎第10.5d開始在胚胎表達，僅特異性地表達于肌節(jié)，在肢芽未見表達。胚胎第11.5d，mst3開始在前肢

6、芽表達，后肢芽未見表達。胚胎第12.5d，mst3開始在顱面和后肢芽表達，在前肢芽的背腹部肌肉團表達。胚胎第13.5d，mst3在初次形成的初級肌管表達。胚胎第16.5d，mst3在初次形成的次級肌管表達。 三、BrdU增生染色和TUNEL凋亡染色初步探討mst3在胚胎骨骼肌發(fā)育過程中的可能機制應用免疫組化方法連續(xù)切片和激光共聚焦技術(shù)觀察胚胎第10.5dmst3的表達與細胞增生，同時也應用免疫組化方法連續(xù)切片觀察胚胎第10.5

7、d和第11.5dmst3的表達和細胞凋亡的關(guān)系，激光共聚焦技術(shù)觀察胚胎第11.5dmst3的表達和細胞凋亡的關(guān)系，以探討mst3在胚胎第10.5d的表達是否通過促進或抑制細胞增生和凋亡在小鼠胚胎骨骼肌發(fā)育中起作用。結(jié)果表明：mst3的表達與細胞增生和凋亡沒有顯著相關(guān)性，可能通過別的機制調(diào)控骨骼肌發(fā)育。 根據(jù)以上實驗結(jié)果，我們得出以下結(jié)論：mst3與小鼠胚胎骨骼肌發(fā)育密切相關(guān)。mst3從胚胎發(fā)育早期開始就特異性表達于肌節(jié)，在骨骼