轉錄因子ISL-1在誘導心室肌細胞向起搏樣細胞轉化過程中的作用及機制研究.pdf

1、心臟正常節(jié)律的沖動起源于竇房結。竇房結區(qū)域在心臟中是一個特化的結構，其內包含的少于1萬個起搏細胞負責整個心臟節(jié)律的產(chǎn)生。當竇房結起搏功能衰竭時，數(shù)以億計的工作肌細胞會出現(xiàn)功能障礙導致緩慢型心律失常，嚴重時會危及生命。作為緩慢型心律失常的新型治療方法，生物起搏旨在修復心臟傳導系統(tǒng)，以恢復心臟的起搏和傳導功能。過表達轉錄因子實現(xiàn)生物起搏是最近研究的熱點。轉錄因子ISL-1是竇房結發(fā)育過程中重要的上游調控因子，在竇房結起搏功能的維持中扮演關鍵

2、的角色。本研究旨在驗證轉錄因子ISL-1在成年小鼠心臟中的表達并探索轉錄因子ISL-1能否誘導心室工作肌細胞向起搏樣細胞轉變，進而實現(xiàn)生物起搏。
　　本研究包含三個實驗:第一部分確定成年小鼠竇房結區(qū)域并對分離得到的起搏細胞進行細胞形態(tài)及電生理特性檢查;第二部分通過熒光定量PCR、蛋白質免疫印跡及組織切片免疫熒光等實驗方法，確定轉錄因子ISL-1在成年小鼠包括竇房結區(qū)域在內的心臟各部位的表達情況;第三部分構建ISL-1基因過表達腺病

3、毒，并利用ISL-1腺病毒作為載體，在體外培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細胞及成年小鼠心室內過表達ISL-1，以驗證ISL-1能否誘導心室工作肌細胞出現(xiàn)起搏樣細胞特征。
　　首先，第一部分實驗確定了小鼠竇房結區(qū)域位于上下腔靜脈與右心房交匯處，并驗證了分離得到的竇房結細胞具備自發(fā)搏動并記錄到If電流，具有典型的起搏細胞形態(tài)及電生理特征，為后續(xù)實驗提供了陽性對照;在第二部分的實驗中，轉錄因子ISL-1的表達情況得以確定，熒光定量實時PCR結果顯

4、示ISL-1主要在成年小鼠的竇房結區(qū)域表達，而在成年小鼠的心室肌細胞中表達較低（僅為竇房結組織的約1/330）;應用蛋白質免疫印跡方法顯示轉錄因子ISL-1高表達于成年小鼠的竇房結區(qū)域，而在成年小鼠的心房及心室組織幾乎不表達;利用免疫熒光可以直接觀察ISL-1的表達及分布情況，ISL-1在竇房結區(qū)域熒光信號最強，而且聚集在細胞核內，而在心室組織中未能檢測到ISL-1的信號。上述三種方法均證實了轉錄因子ISL-1高表達于成年小鼠的竇房結區(qū)

5、域，而在成年小鼠的心室肌細胞內幾乎不表達。最后利用構建的腺病毒作為載體，在體外培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細胞中過表達了ISL-1后，細胞形態(tài)發(fā)生類竇房結細胞樣變化。同時，細胞的自律性顯著提高。同樣通過在成年小鼠心室內注射腺病毒使其過表達轉錄因子ISL-1，可以誘導小鼠出現(xiàn)頻發(fā)室性早搏。通過給予異丙腎上腺素刺激，ISL-1過表達小鼠出現(xiàn)房室分離，室性節(jié)律快于竇性心律。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ISL-1過表達誘導的心室自律性的提高與心室肌細胞表達譜向起搏