腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞抑制結(jié)腸癌的生長與轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的:
　　探究腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（EGCs）在結(jié)腸癌生長和轉(zhuǎn)移中的作用。
　　方法:
　　1、體外實驗
　　實驗分EGCs+CT26.WT組和CT26.WT組，前組采用共培養(yǎng)小室或Transwell小室構(gòu)建EGCs與CT26.WT細(xì)胞共培養(yǎng)體系，后者單獨培養(yǎng)CT26.WT細(xì)胞。采用BrdU法、MTT法檢測EGCs對CT26.WT細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測EGCs對CT26.WT細(xì)胞周期和凋亡的影響，侵襲實驗檢測

2、EGCs對CT26.WT細(xì)胞侵襲能力的影響，劃痕實驗檢測EGCs對CT26.WT細(xì)胞遷移能力的影響，Western Blot檢測EGCs干預(yù)后CT26.WT細(xì)胞中Caspase3和Cleaved-Caspase3的表達(dá)情況。
　　2、體內(nèi)實驗
　　隨機數(shù)字法將28只SPF級近交系BALB/c小鼠分為四組：實驗組（EGCs組）、溶劑對照組（DMEM組）、模型組（Model組）和對照組（Control組）。將四組小鼠分批進行腹腔

3、手術(shù)，前三組小鼠脾臟下極注射CT26.WT單細(xì)胞懸液構(gòu)建CT26.WT細(xì)胞小鼠脾臟移植瘤模型，Control組小鼠脾臟下極注射等量生理鹽水。手術(shù)當(dāng)天起每日相同時間EGCs組腹腔注射EGCs培養(yǎng)上清0.1mL，DMEM組腹腔注射DMEM完培0.1mL，Model組和Control組腹腔注射無菌生理鹽水0.1mL。隔日測小鼠體重。2周后處死小鼠，取出脾、肝、腦、肺、腎，肉眼和病理觀察其原位成瘤和臟器轉(zhuǎn)移情況。免疫組化檢測脾臟原位瘤Ki67表

4、達(dá)情況，Western Blot檢測脾臟原位瘤體及肝臟轉(zhuǎn)移瘤體內(nèi)結(jié)腸癌生長轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白DDR1、Vimentin、E-cadherin、HIF-2α/VEGFA、VEGFC和PTEN/PI3K-p110/AKT/MDM2/P53/P21的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、體外實驗
　　1）增殖實驗（BrdU、MTT）：BrdU和MTT法均證實——與CT26.WT組相比，EGCs抑制CT26.WT細(xì)胞增殖速度，差異均有統(tǒng)計學(xué)意

5、義（p＜0.05）；
　　2）侵襲實驗：與CT26.WT組相比，EGCs減弱CT26.WT細(xì)胞的侵襲能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；
　　3）劃痕實驗：與CT26.WT組相比，EGCs減弱CT26.WT細(xì)胞的遷移能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；
　　4）細(xì)胞周期：與CT26.WT組相比，EGCs+CT26.WT組CT26.WT細(xì)胞G0/G1期比例升高，S期比例下降，G2/M期比例略升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意

6、義（p＜0.05）；
　　5）細(xì)胞凋亡：與CT26.WT組相比，EGCs+CT26.WT組CT26.WT細(xì)胞早期凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。晚期凋亡兩組無明顯差異；
　　6）Western Blot檢測Caspase3與Cleaved-Caspase3的表達(dá)：與CT26.WT組相比，EGCs+CT26.WT組CT26.WT細(xì)胞中Caspase3表達(dá)降低，而Cleaved-Caspase3的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)

7、計學(xué)意義（p＜0.05）。
　　2、體內(nèi)實驗
　　1）體重：EGCs組小鼠術(shù)后第12天及第14天體重升高較DMEM組明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；
　　2）成瘤與轉(zhuǎn)移情況：EGCs組、DMEM組、Model組三組BALB/c小鼠均出現(xiàn)肉眼可見脾臟原位瘤及肝臟轉(zhuǎn)移瘤。DMEM組、Model組出現(xiàn)1至多個腎臟、肺和腦組織的病理轉(zhuǎn)移灶，而EGCs組無腎臟、肺和腦組織的病理轉(zhuǎn)移灶；
　　3）脾臟原位瘤直徑：EGCs組脾臟原位瘤

8、直徑小于DMEM組和Model組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；
　　4）脾臟原位瘤體Ki-67免疫組化：EGCs組Ki-67的表達(dá)較DMEM組和Model組低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；
　　5）脾臟原位瘤體Western Blot：EGCs組E-cadherin、PTEN、P53和P21表達(dá)較DMEM組和Model組高，DDR1、Vimentin和VEGFA表達(dá)較DMEM組低，VEGFC、HIF-2α、P

9、I3K-p110、AKT和MDM2表達(dá)較DMEM組和Model組低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；
　　6）肝臟轉(zhuǎn)移瘤體Western Blot：EGCs組E-cadherin、PTEN、P53和P21表達(dá)較DMEM組和Model組高，MDM2表達(dá)較DMEM組低，DDR1、Vimentin、VEGFA、VEGFC、HIF-2α、PI3K-p110和AKT表達(dá)較DMEM組和Model組低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）