耐RNase病毒樣顆粒的構建及應用.pdf

1、第一部分內含中東呼吸綜合征冠狀病毒和埃博拉病毒基因片段病毒樣顆粒的構建及表達
　　2012年9月世界衛(wèi)生組織（WHO）報道,在中東地區(qū)的一位患有急性呼吸道疾病的病人中發(fā)現(xiàn)了一種新的SARS樣冠狀病毒，患者表現(xiàn)為急性呼吸道感染和腎功能衰竭等臨床癥狀。后來該新型人冠狀病毒病原體被命名為中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）。1976年在非洲國家發(fā)現(xiàn)了埃博拉病毒，它是引起埃博拉出血熱的烈性傳染病的病原，是一種目前人類已知的恐怖、致命

2、的病毒之一。2013年埃博拉出血熱重新在西非幾個國家爆發(fā)，雖然我國目前沒有相關疫情的爆發(fā)，但是不能排除輸入性病例的可能。雖然有實驗室已經建立了多種檢測這兩種病毒核酸的方法，但尚無質控品或安全可靠的陽性參考品。因此，需要一種RNA質控品全程監(jiān)控及保證檢測結果的可靠性。
　　目的:
　　構建內含中東呼吸綜合征冠狀病毒部分基因和埃博拉病毒部分GP和NP基因病毒病毒樣顆粒，作為核酸檢測的質控品。該質控品具有穩(wěn)定好、耐 RNase、無

3、潛在生物傳染性的危害的優(yōu)勢，可用于全程監(jiān)控RNA病毒核酸檢測，對于中東呼吸綜合征冠狀病毒和埃博出血熱病毒的實驗室診斷具有重要意義及實用價值。
　　方法:
　　將 MS2噬菌體包膜蛋白和成熟酶蛋白基因編碼序列插入到表達載體pET32a，構建成 p32MS中間載體，再 MERS-CoV N基因和埃博拉病毒部分GP和 NP基因病毒基因片段連接到成熟酶蛋白基因的下游，獲得的重組載體p32MS-X(MERS或Ebola)轉化到E.co

4、li BL21(DE)感受態(tài)細胞中進行誘導表達，表達產物進行純化，然后進行耐酶實驗及穩(wěn)定性實驗。結果獲得含 MERS-CoV N基因片段的顆粒和埃博拉GP和NP基因片段顆粒，可抵抗RNase降解，在4℃保存至少120天。
　　結果:
　　成功構建了含 MERS-CoV N基因和埃博拉病毒 GP和 NP基因 VLPs，可抵抗RNase降解，在4℃保存120天。
　　結論:
　　成功構建了含MERS-CoV N基因和

5、埃博拉病毒GP和NP基因的VLPs，其安全、穩(wěn)定良好，可作為檢測MERS-CoV和Ebola virus核酸的標準品和質控品。
　　第二部分VLPs在多重RT-PCR檢測呼吸道病毒中的應用
　　呼吸道病毒是最主要引起人類呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率的原因之一，特別是嬰幼兒和老人。近年來市場上有多種多重檢測呼吸道病毒的商業(yè)試劑盒，但費用很高，且使用過程中需要專用設備，很難推廣使用。
　　目的:
　　我們已經建立了基

6、于QIAxcel自動化毛細管電泳儀的兩管同時檢測16種呼吸道病毒的方法（9+7方法），本研究擬通過進一步的改進使之成為一種靈敏度高、特異性更好、內參穩(wěn)定，更高效迅速的方法，進一步提高全國疾控系統(tǒng)常規(guī)監(jiān)測呼吸道病毒的能力。
　　方法:
　　改進已經建立兩管同時檢測16種呼吸道病毒的方法為一管檢測13種呼吸道病毒及亞型（13重法），能檢測到的呼吸道病毒包括：甲型流感病毒(FluA)，乙型流感病毒(FluB)，09年季節(jié)性流感病毒

7、 H1N1亞型(09H1N1)，季節(jié)性流感病毒H3N2亞型 H3N2(sH3N2)，副流感病毒1-4型(PIV1-4)，鼻病毒(HRV)，腺病毒(Adv)，呼吸道合胞病毒 A型(RSVA)，呼吸道合胞病毒 B型(RSVB)和人偏肺病毒(HMPV)。在提取樣本核酸前中加入噬菌體MS2 VLPs作為內參，針對13種病毒及亞型設計14對嵌合引物、一個通用引物(Tag)、一對內參引物(MS2 F, MS2 R)，所有引物均加入一個反應體系，并優(yōu)

8、化擴增條件。用兩管檢測16種呼吸道病毒的方法作為參考標準，并使用310份臨床標本對這兩種方法進行評價和比較，對兩種方法檢測結果不一致再重復試驗和測序驗證。
　　結果:
　　建立了一種基于 Qiaxcel系統(tǒng)的單管多重 RT-PCR檢測13種呼吸道病毒及亞型的方法。通過檢測310份臨床標本，與已建立的兩管同時檢測16種呼吸道病毒的方法比較，陽性率分別為72.90％和69.03%。兩種方法檢測病毒的一致高達97.10%，單管多重

9、 RT-PCR檢測腺病毒、鼻病毒、人偏肺病毒和副流感病毒1型和3型的靈敏度明顯高于兩管法，表明單管多重 RT-PCR檢測呼吸道病毒的體系靈敏度和特異更好。
　　結論:
　　1.噬菌體 MS2 VLPs作為穩(wěn)定內參保證了單管多重 RT-PCR檢測呼吸道病毒結果的有效性。
　　2.單管多重 RT-PCR檢測呼吸道病毒的方法有更穩(wěn)定的內部質控，特異性和靈敏度更好，更快速和方便檢測的優(yōu)勢具有在全國疾控系統(tǒng)應用于呼吸道病毒感染中