構(gòu)建及篩選S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子用于蛋白質(zhì)定點(diǎn)標(biāo)記.pdf

1、蛋白質(zhì)內(nèi)含子是位于宿主蛋白質(zhì)中的插入序列，在蛋白成熟過(guò)程中自我去除，并以肽鍵連接兩側(cè)的宿主蛋白質(zhì)序列(稱(chēng)為蛋白外顯子)，蛋白質(zhì)這一成熟過(guò)程被稱(chēng)為蛋白質(zhì)剪接。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子是指蛋白質(zhì)內(nèi)含子被分裂成兩部分即N端區(qū)域(IN)和C端區(qū)域(IC)，分別由不同的開(kāi)放閱讀框表達(dá)。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的獨(dú)特性是能夠分段表達(dá)或合成，并且能夠特異性識(shí)別，為蛋白質(zhì)合成和修飾提供了新的途徑，因而在蛋白質(zhì)工程及其它領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 在蛋白質(zhì)標(biāo)

2、記領(lǐng)域，應(yīng)用新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子對(duì)目的蛋白特異位點(diǎn)進(jìn)行修飾或標(biāo)記，有助于更深入地研究目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。目前在蛋白質(zhì)標(biāo)記領(lǐng)域中所采用的是人工構(gòu)建的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，該方法用于定點(diǎn)標(biāo)記的局限性在于：(1)異源宿主中蛋白質(zhì)剪接效率可能大大降低甚至不能發(fā)生剪接反應(yīng)，并且其剪接需要的蛋白質(zhì)外顯子的氨基酸也是特定的，限制了蛋白質(zhì)內(nèi)含子的應(yīng)用范圍；(2)大片段的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子與目的蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，這樣可能造成目的蛋白可溶性的改變或其它不可知的

3、影響；(3)人工合成小肽增加了實(shí)驗(yàn)成本等。
　　 為克服上述局限性，本課題構(gòu)建6個(gè)新型的S1型斷裂蛋白內(nèi)含子，將其C端半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，并且將兩側(cè)的天然外顯子替換為一段通用性高的連接小肽(GG-SAG)，對(duì)新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子體內(nèi)和體外的剪接活性進(jìn)行檢測(cè)，篩選出合適的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子進(jìn)行應(yīng)用。
　　 本文利用實(shí)驗(yàn)室已有的微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子進(jìn)行改造，成功構(gòu)建了6個(gè)C端無(wú)半胱氨酸的S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子(稱(chēng)為CF-inte

4、in)，通過(guò)對(duì)體內(nèi)剪接活性的分析，篩選出3個(gè)具有相對(duì)較高剪接活性的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子(CFRBS1，CFTXS1和CFSXS1)進(jìn)行體外剪接活性檢測(cè)。結(jié)果分析表明：CFRBS1 intein具有較穩(wěn)定的剪接活性，較高的剪接活性以及較快的剪接速率；同時(shí)模式蛋白的標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果也顯示，CFRBS1 intein可進(jìn)行蛋白質(zhì)定點(diǎn)標(biāo)記應(yīng)用。
　　 本課題中期望改造后的S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子在進(jìn)行應(yīng)用時(shí)，特異性較高，不僅可以帶上熒光基團(tuán)、標(biāo)簽