大豆疫霉RxLR效應分子Avh262和Avh172的功能研究.pdf

1、隸屬于卵菌的疫霉屬包含120多個物種，其中大多數(shù)為破壞性的植物病原菌。作為一個半活體營養(yǎng)型的病原卵菌，疫霉菌在侵染寄主過程中可以分泌一系列效應分子，包括RxLR類效應分子來干擾寄主的防御反應，從而促進病原菌在寄主中的定殖。大豆疫霉的基因組包含400多個編碼RxLR效應分子的基因，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)效應分子可以通過精確轉(zhuǎn)錄調(diào)控和團隊協(xié)作來抑制植物的免疫反應，但是這些效應分子如何通過與寄主植物免疫反應的調(diào)控因子相互作用，如何干擾植物的免疫

2、目前所知甚少。本研究首先對具有抑制植物免疫反應能力的38個效應分子的亞細胞定位進行了分析，在此基礎上對效應分子Avh262和Avh172抑制植物免疫反應的分子機制進行了研究，此外還對大豆-大豆疫霉親和/非親和互作過程中的大豆蛋白質(zhì)組進行了分析。主要研究內(nèi)容包括:
　　一、大豆疫霉RxLR效應分子的亞細胞定位分析。本研究對大豆疫霉RxLR效應分子分析，發(fā)現(xiàn)共26個效應分子具有核定位信號。對其中8個具有核定位信號效應分子進行定位分析，

3、發(fā)現(xiàn)均主要定位于細胞核中。本研究發(fā)現(xiàn)具有核定位信號的效應分子Avh52在細胞核中呈現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài)，核定位信號對其特殊定位和促進侵染的能力是必需的。本研究對38個大豆疫霉毒性所必需和/或能抑制植物免疫的RxLR效應分子進行亞細胞定位分析，發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)RxLR效應分子定位于細胞核和細胞質(zhì)中，效應分子Avh172、Avh262以及Avr1d能在病原菌侵染過程中聚集在吸器周圍，這說明了它們可以在吸器周圍發(fā)揮毒性作用來抑制寄主的免疫反應。此外，

4、本研究發(fā)現(xiàn)Avh262定位于植物細胞的微管中，這是首次發(fā)現(xiàn)定位于微管的效應分子。運用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)Avh262能向植物的微管中進行轉(zhuǎn)移和聚集。
　　二、效應分子Avh262通過穩(wěn)定BiPs調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力從而促進病原菌的侵柒。本研究發(fā)現(xiàn)保守的大豆疫霉效應分子Avh262在大豆疫霉侵染大豆早期上調(diào)表達。對疫霉的Avh262進行沉默后對大豆喪失了致病力。Avh262在大豆發(fā)狀根和煙草中的過表達能夠顯著促進大豆疫霉或辣椒疫

5、霉的侵染。為了探索Avh262抑制植物免疫的分子機制，通過煙草體內(nèi)Co-IP和LC-MS/MS技術篩選到了Avh262的靶標蛋白Endoplasmic Reticulum(ER)-luminal Binding immunoglobulin Proteins(BiPs)。利用Co-IP和Pull down驗證Avh262能夠與大豆的四個GmBiPs以及煙草中的NbBiP5互作。此外Avh262能夠與BiP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上共定位。本研究發(fā)現(xiàn)過表

6、達BiP時，會有部分BiP蛋白進行降解，而Avh262和蛋白酶抑制劑MG132能阻止BiP的降解，本研究證實Avh262能穩(wěn)定BiP使其維持在較高的蛋白水平。同時Avh262中的Bips-bindingdomain不僅對其促進侵染的功能是必需的，在Avh262穩(wěn)定BiP的過程中也是必不可少的。BiP在煙草和大豆發(fā)狀根中過表達能夠促進疫霉菌的侵染，而在煙草中沉默NbBiP5則會增強煙草對疫霉的抗性，這說明BiPs是一個植物抗疫霉的負調(diào)控因

7、子。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)大豆和煙草的BiPs和Avh262能夠抑制BAX引起的細胞死亡。然而沉默了Avh262的大豆疫霉轉(zhuǎn)化子在侵染大豆時無法穩(wěn)定BiP并引起植物細胞死亡，這說明BiP能緩解侵染過程中由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力引起的植物細胞死亡。通過該研究發(fā)現(xiàn)了病原菌效應分子抑制植物免疫反應的新機制:在侵染早期大豆疫霉可以分泌效應分子Avh262進入寄主細胞，通過穩(wěn)定BiPs來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力誘導的細胞死亡，降低寄主對病原菌侵染的敏感度，從而促進疫霉菌的

8、定殖。
　　三、Avh172的功能分析和靶標篩選。將一個在侵染過程中高量表達的IE(Immediately-Early)類效應分子Avh172融合RFP后在大豆疫霉中過表達，發(fā)現(xiàn)Avh172-RFP可以在侵染的大豆細胞中聚集在侵染孔口和吸器周圍。Avh172在煙草細胞中表達時定位于細胞核和細胞質(zhì)中。當利用融合RFP的辣椒疫霉侵染時，Avh172能夠聚集在辣椒疫霉的吸器和侵染點附近。來自不同生理小種菌株中的Avh172具有不同的定位

9、，但是都能抑制效應分子引起的細胞死亡。Avh172 C端的亮氨酸對其核仁定位和抑制效應分子引起細胞死亡的功能具有重要的作用。此外將Avh172在大豆發(fā)狀根中進行表達，通過Co-IP和LC-MS/MS技術篩選到了4個候選的靶標蛋白。
　　四、大豆疫霉與大豆親和互作及非親和互作過程中大豆蛋白質(zhì)組學分析。本研究利用非親和互作的Williams82-P6497以及親和互作的Williams82-P7076作為實驗材料，通過雙向電泳技術進行

10、大豆疫霉與大豆親和互作及非親和互作的大豆蛋白質(zhì)組學研究。通過質(zhì)譜分析，本研究共鑒定到了83個差異表達的蛋白?；谶@83個防衛(wèi)反應過程相關蛋白，本研究利用qRT-PCR實驗補充完善大豆抗病信號途徑中相關基因的表達模式。分析結(jié)果顯示抗病植物中ROS迸發(fā)、SA途徑以及異黃酮合成相關基因和蛋白是上調(diào)表達的，從而說明了在大豆疫霉侵染過程中，大豆的ROS、SA途徑和異黃酮的合成起著至關重要的作用。本研究可以為今后大豆疫霉與大豆互作中抗病反應的分子機