整合子—耐藥基因盒系統(tǒng)介導食源微生物耐藥機制的研究.pdf

1、為了探討第一類整合子在食源性細菌耐藥機制中的介導作用,對來自廣州市健康食品從業(yè)人員分離到的23株沙門氏菌做第一類整合子的篩選.首先研究了它們對10種常用抗生素耐藥性情況.結果表明所有的菌株對其中至少一種抗生素產生耐藥.應用PCR法和菌落雜交方法檢測第一類整合子,發(fā)現(xiàn)4株第一類整合子陽性菌株,以IN-F和IN-B對其整合的耐藥基因盒進行擴增,并對擴增片段進行序列分析.結果表明,在4株第一類整合子陽性菌株中,2株各產生一個1009bp片段,

2、1株產生一個1664bp片段,1株產生1009bp和1664bp兩個片段.序列分析結果表明,1009bp為aadA2耐藥基因盒,對鏈霉素和壯觀霉素產生耐藥.1664bp含有aadA5和dfr17兩個耐藥基因盒,分別對鏈霉素、壯觀霉素和甲氧氨芐嘧啶耐藥.為了研究第一類整合子的基因定位及其拷貝數,進行了Southern雜交實驗和質粒接合實驗.選擇在第一類整合酶基因intI1無酶切位點的EcoR Ⅰ和EcoR Ⅴ對染色體DNA進行限制性酶切,

3、酶切后的染色體DNA和質粒DNA分別與PCR產生的并由地高辛標記的intI1探針進行雜交,在質粒DNA上無雜交信號.同時在質粒的接合轉移實驗中無接合子產生,說明了第一類整合子不存在于質粒DNA上.而染色體DNA的雜交實驗表明了第一類整合子的位置和拷貝數,S.tshiongwe S14和S.tshiongwe S126為2個拷貝,S.tshiongwe S191和S.hadar S87為單拷貝.以4株第一類整合子陽性菌株和4株整合子陰性菌

4、株為研究對象,用任意引物PCR(AP-PCR)和腸桿菌間間隔重復序列PCR(ERIC-PCR)兩種方法測定DNA指紋圖譜,來分析菌株第一類整合子的特性與基因分型之間的關系.兩種方法對實驗菌株確定出統(tǒng)一并與第一類整合子特性相關的基因型,而AP-PCR方法較ERIC-PCR方法比較,在區(qū)分菌體基因型方面能力更強.為研究第一類整合酶基因對耐藥基因盒捕獲和表達的調控因子和調控過程,采用了反向PCR方法擴增第一類整合酶基因上游未知的DNA片段.用