五行湯抑制腫瘤細胞生長及機制的研究.pdf

1、[目的]“五行湯”由牛蒡、白蘿卜、胡蘿卜、干香菇和干白蘿卜葉配制而成,民間服用有一定的抗腫瘤效果,值得深入研究。在大力發(fā)展傳統(tǒng)醫(yī)藥的今天,本課題結合現(xiàn)代分子生物學技術觀察研究五行湯的抗癌效果及其機制。
　　 [方法]1、不同批次五行湯穩(wěn)定性鑒定:紫外-可見光吸收光譜分析和成分定性檢測,比較不同產(chǎn)地和不同貯存時間的五行湯組分相似度;不同批次五行湯處理腫瘤細胞,設立濃度梯度,MTT法檢測比較抑瘤作用。2、五行湯促腫瘤細胞SGC-79

2、01死亡方式檢測:熒光染色和電鏡觀察細胞形態(tài)學變化;AnnexinV-FITC/PI雙標法檢測凋亡率。3、五行湯促SGC-7901細胞凋亡分子機制的探究:蛋白印跡檢測凋亡途徑蛋白變化;鈣離子特異性熒光探針檢測胞漿鈣離子濃度變化;吖啶橙染色檢測溶酶體膜完整性;AnnexinV結合實驗和CCK-8法檢測不同抑制劑對細胞凋亡和存活的影響。
　　 [結果]選取不同產(chǎn)地原料,在不同時間按標準流程配制不同批次五行湯;紫外-可見光吸收光譜顯示

3、不同批次五行湯吸收峰波形相似。不同批次五行湯主要成分定性實驗結果一致:蛋白質(zhì)、酚類、黃酮檢測均為陽性、生物堿檢測均為陰性。不同批次五行湯均可抑制腫瘤細胞SGC-7901生長,且抑制作用接近。PI熒光染色和電鏡觀察到五行湯處理的SGC-7901細胞呈凋亡特征;AnnexinV-FITC/PI雙標流式檢測到五行湯促SGC-7901細胞凋亡作用。免疫印跡檢測半胱天冬氨酸酶(caspase)家族蛋白無活化跡象;AnnexinV結合實驗檢測到廣譜

4、caspase抑制劑對細胞凋亡沒有影響。熒光探針檢測到胞漿鈣離子濃度升高;胞內(nèi)鈣離子拮抗劑BaptaAM可以明顯降低五行湯誘導的SGC-7901細胞凋亡(P＜0.05),且對細胞保護作用呈濃度依賴性。吖啶橙(AO)染色觀察到溶酶體膜滲漏;胞漿蛋白免疫印跡檢測到溶酶體釋放蛋白酶cathepsinD和cathepsinB至胞漿;天冬氨酸蛋白酶cathepsinD抑制劑對五行湯誘導的細胞凋亡沒有影響;半胱氨酸蛋白酶cathepsinB、L、S

5、抑制劑可以明顯減少細胞凋亡(P＜0.05),且對細胞的保護作用呈濃度依賴性。胞內(nèi)鈣離子拮抗劑BaptaAM可以減少溶酶體膜滲漏。JC-1染色檢測出線粒體膜電位降低;胞漿蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)線粒體沒有釋放細胞色素C(cytoC)而選擇性釋放凋亡誘導因子(AIF);核蛋白免疫印跡顯示AIF沒有入核;AIF抑制劑和鈣蛋白酶calpain抑制劑均對五行湯誘導的SGC-7901細胞凋亡沒有保護作用。
　　 [結論]一定范圍內(nèi)的不同批次五行湯組