骨髓來(lái)源血管內(nèi)皮前體細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下增殖分化能力的觀(guān)察.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?EPCs可以有效的介導(dǎo)缺血組織的新生血管生成,具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值,但目前尚未有成熟的EPCs分離和擴(kuò)增方法,而且目前國(guó)際上用于分離和培養(yǎng)EPCs的方法造價(jià)極高,勢(shì)必影響EPCs在中國(guó)的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用,故該實(shí)驗(yàn)旨在尋找一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效的分離、純化和擴(kuò)增EPCs的方法,為其進(jìn)一步的基礎(chǔ)或臨床研究提供條件.實(shí)驗(yàn)方法第一部分:內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下骨髓來(lái)源單核細(xì)胞中EPCs的增殖和分化.在無(wú)菌的條件下抽取大鼠骨髓,用密度梯度離

2、心法分離骨髓單核細(xì)胞,將細(xì)胞分為三組,接種在添加不同濃度ECGS的基礎(chǔ)內(nèi)皮培養(yǎng)基中:A組:含ECGS 300ug/ml;B組:含ECGS 200 ug/ml;C組:含ECGS 100ug/ml.在培養(yǎng)的前中后期,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、vWF和eNOS的陽(yáng)性細(xì)胞百分比.至培養(yǎng)終點(diǎn),將細(xì)胞進(jìn)行原位免疫熒光染色,標(biāo)記vWF和eNOS,在熒光顯微鏡下觀(guān)察.第二部分:在內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下添加不同影響因素對(duì)EPC

3、s的增殖和分化的影響.同第一部分分離大鼠骨髓單核細(xì)胞,將細(xì)胞分為三組,分別接受不同處理:A組:與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)共培養(yǎng);B組:在內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)因子VEGF、bFGF;C組:僅應(yīng)用內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng).在培養(yǎng)的前中后期,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34,vWF和eNOS的陽(yáng)性細(xì)胞百分比.結(jié)論1、新分離出的骨髓單核細(xì)胞CD34+細(xì)胞百分比為(42.3~47.1)％,說(shuō)明其中復(fù)含EPCs,極少量的細(xì)胞表達(dá)

4、vWF和eNOS,說(shuō)明新分離的骨髓單核細(xì)胞中分化成熟的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量少.2、應(yīng)用內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以促進(jìn)骨髓單核細(xì)胞中EPCs的增殖和分化.EPCs的增殖能力有ECGS的濃度依賴(lài)性,以300ug/ml為佳,200ug/ml有較好的效價(jià)比.3、與僅用內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比,與HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)或在培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)因子VEGF和bFGF均可促進(jìn)骨髓來(lái)源單核細(xì)胞中EPCs的增殖和分化,其中以添加生長(zhǎng)因子的刺激作用最強(qiáng),與HUVEC共培養(yǎng)在一定程度上