編碼磷酸酯酶新基因的克隆、表達及產(chǎn)物的生化性質(zhì)鑒定.pdf

1、磷酸酯酶廣泛存在于生物體內(nèi)，在生物的磷代謝中起到重要的作用。在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中控制蛋白的磷酸化，協(xié)調(diào)組織生理生化功能。由于其來源不同，具有不同的特性而被廣泛應(yīng)用與分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中。本研究對來自于堿性污染土壤宏基因組文庫中的表達磷酸酯酶活性的陽性克隆pGXA1009進行了亞克隆并序列分析，得到可能編碼磷酸酯酶基因的開放閱讀框，將其命名為phop1。
　　 生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，phop1是由1389個堿基對

2、組成，編碼463個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量約51451.79 Da，理論等電點pI為6.26。該基因在GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸水平上與已知的基因沒有相似性，在氨基酸水平上，Phop1與來自Thermincola potens(登錄號：YP003639845.1)的含PHP域磷酸酯酶蛋白的一致性為28%，相似性為45%。氨基酸序列分析比較結(jié)果表明，Phop1與PHP域家族蛋白的保守基序具有一定的相似性，可能具有磷酸酯酶功能。由此我

3、們鑒定Phop1可能為PHP蛋白家族的新成員。
　　 我們對phop1基因的ORF進行PCR擴增，與表達載體pETBlue-2連接并導(dǎo)入表達宿主細胞Rosetta-gamiTM2(DE3)placI進行目的基因的過量表達，經(jīng)鎳柱純化，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示得到了與預(yù)測分子量大小一致的蛋白條帶。對重組蛋白Phop1進行了生化性質(zhì)研究，以pNPP為底物，發(fā)現(xiàn)Phopl的最適pH為6.0，最適作用溫度為50℃，該酶對高溫表現(xiàn)有

4、一定適應(yīng)性和熱穩(wěn)定性。在最適條件下的測得酶活力為1.21U/mg，采用Lineweaver-Burk作圖法，Phopl的表觀米氏常數(shù)Km為0.130 mM，最大反應(yīng)速率Vmax為35.2μM/min，Na2HPO4對酶的抑制作用為線性競爭性抑制，抑制常數(shù)Ki約為0.952 mM。Mg2+和Co2+在0.5-2 mM范圍內(nèi)對Phop1的酶活有一定的促進作用，EDTA作用呈明顯的抑制性。本研究通過完成未培養(yǎng)微生物編碼磷酸酯酶的新基因的功能鑒