自身免疫調(diào)節(jié)因子對大分子自噬及細胞吞噬功能的影響.pdf

1、目的
　　 自身免疫調(diào)節(jié)因子（AIRE）具有誘導中樞免疫耐受的潛能，但在外周免疫耐受中，其功能未明?？紤]大分子自噬可參與免疫耐受的誘導，我們初步探討了自身免疫調(diào)節(jié)因子在外周中的表達及其對外周單核細胞系THP-1大分子自噬的影響。
　　 方 法
　　 真核表達載體Pegfp-AIRE經(jīng)雙限制性酶切、PCR擴增及DNA測序分析鑒定；依據(jù)密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法進行外周血單個核細胞及單核細胞的分離；THP-1細胞由佛波

2、醇酯誘導分化后通過瑞氏-姬姆薩染色進行形態(tài)學鑒定；細胞轉(zhuǎn)染按脂質(zhì)體法進行；AIRE表達抑制采用siRNA的方法；熒光顯微鏡觀察GFP-AIRE融合蛋白的表達和亞細胞定位；轉(zhuǎn)染效率經(jīng)RT-PCR與Western Blot進行驗證；自噬小體在胞內(nèi)的形成和定位通過間接免疫熒光染色指示；大分子自噬的抑制采用PI3K抑制劑（渥曼青霉素）進行誘導；LC3B-Ⅱ與p62/SQSTM1的蛋白表達變化經(jīng)Western Blot進行檢測。
　　 結(jié)

3、 果
　　 質(zhì)粒DNA經(jīng)雙酶切、PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳后可見特異性條帶；DNA測序結(jié)果顯示測定序列與AIRE（NM_000383.2）基因序列符合率99％（BLAST評分1698）。外周血單個核細胞、單核細胞、U937和THP-1細胞存在AIRE Mrna表達；單核細胞和THP-1細胞僅表達低水平AIRE蛋白。誘導后，THP-1細胞呈貼壁生長，胞體增大，形態(tài)多樣性，核不規(guī)則，胞漿內(nèi)空泡，吞噬細胞碎片等典型成熟分化形態(tài)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)

4、染48小時后，熒光顯微鏡顯示GFP-AIRE融合蛋白以斑點狀定位于細胞核內(nèi)；在Mrna和蛋白水平，AIRE均呈明顯高表達；而AIRE siRNA則明顯抑制GFP-AIRE融合蛋白及AIRE Mrna與蛋白的表達。過表達AIRE可上調(diào)LC3B-Ⅱ的表達和自噬小體的形成；而大分子自噬抑制劑與AIRE siRNA可抑制AIRE介導的上調(diào)效應。過表達AIRE或大分子自噬抑制劑與AIRE siRNA對p62/SQSTM1蛋白表達無影響。
　

5、　 結(jié) 論
　　 真核表達載體Pegfp-AIRE構(gòu)建正確，可應用于體外轉(zhuǎn)染研究。AIRE可表達于外周單核細胞并通過上調(diào)LC3B-Ⅱ的表達和自噬小體的形成促進單核細胞大分子自噬。AIRE介導單核細胞大分子自噬的信號轉(zhuǎn)導通路可能與p62/SQSTM1蛋白無關(guān)。通過促進單核細胞大分子自噬，AIRE可能在外周免疫耐受中具有功能。
　　 第二部分 自身免疫調(diào)節(jié)因子與凋亡細胞的吞噬清除
　　 目的
　　 凋亡細胞

6、是自身抗原成分的主要來源之一，適時清除凋亡細胞對維持免疫自穩(wěn)具有重要意義。作為細胞死亡的兩種不同形式——大分子自噬與凋亡共享許多調(diào)節(jié)因子，基于本文第一部分研究結(jié)果，為繼續(xù)探討自身免疫調(diào)節(jié)因子（AIRE）在外周免疫耐受中的功能，我們在非“職業(yè)”吞噬細胞——上皮細胞系16HBE中探討了AIRE對吞噬凋亡細胞的影響。
　　 方 法
　　 16HBE細胞的轉(zhuǎn)染使用來源于第一部分研究的真核表達載體Pegfp-AIRE通過FuGEN

7、E HD轉(zhuǎn)染法進行；轉(zhuǎn)染效率經(jīng)熒光顯微鏡、RT-PCR與Western Blot進行驗證；HL-60細胞的凋亡由喜樹堿誘導后通過Annexin V-FITC/碘化丙啶雙染色進行流式細胞儀檢測；吞噬凋亡細胞的檢測通過髓過氧化物酶(MPO)染色進行顯示；吞噬相關(guān)基因（Rac 1）的表達變化經(jīng)RT-PCR與Western Blot進行檢測。結(jié) 果
　　 Pegfp-AIRE轉(zhuǎn)染48小時后，熒光顯微鏡顯示GFP-AIRE融合蛋白以斑點狀

8、定位于16HBE細胞核內(nèi)；通過RT-PCR與Western Blot檢測，AIRE Mrna和蛋白均呈明顯高表達。對比未經(jīng)凋亡誘導的陰性對照組，流式細胞儀檢測顯示，喜樹堿誘導的HL-60細胞凋亡率上升約3倍[（4.08±0.26）％vs（13.46±1.71）％]。在與凋亡細胞共孵育1小時后，可見轉(zhuǎn)AIRE基因16HBE細胞吞噬率為（25.5±3.67）％，而轉(zhuǎn)染空載體16HBE細胞吞噬率為（6.25±1.58）％，兩者間具有顯著性差異

9、（P＜0.05）；但過表達AIRE對16HBE細胞吞噬未凋亡細胞無明顯影響[（1.0±0.67）％]。同時，過表達AIRE可上調(diào)16HBE細胞Rac 1Mrna和蛋白表達。
　　 結(jié) 論
　　 16HBE細胞對凋亡細胞具有基礎(chǔ)吞噬率，可作為體外研究吞噬凋亡細胞的細胞模型。MPO染色法對檢測吞噬來源于MPO陽性靶細胞的吞噬效應具有較好對比度，可作為體外顯示吞噬效應的檢測方法。AIRE可促進上皮細胞對凋亡細胞的吞噬，通過上調(diào)