馬氏珠母貝珍珠層基質(zhì)蛋白基因的克隆與功能研究.pdf

1、本文在實驗室前期研究基礎上，以本課題組馬氏珠母貝基質(zhì)蛋白全譜為基礎，并以在珍珠囊和中央膜轉錄組數(shù)據(jù)庫中高表達為依據(jù)，篩選出可能與珍珠層形成相關的6個基因:4個沒有功能注釋的新基因和2個有絲氨酸蛋白酶抑制劑功能注釋的基因。通過RACE和基因克隆技術獲得這些基因的全長，對其序列的結構特征進行分析，通過Real-time PCR技術對各個基因進行組織差異表達分析，RNA干擾結合Real-time PCR及掃描電子顯微鏡(SEM)觀察等技術對其

2、在珍珠層形成中的功能進行初步分析，原位雜交技術研究基因的表達定位，進一步采用原核表達技術獲得重組蛋白并通過western blot技術進行驗證，為確認珍珠層形成相關的礦化基因與蛋白的對應關系，揭示珍珠層的分子調(diào)控機制研究提供依據(jù)。
　　1.四個沒有功能注釋的新基因按已有命名規(guī)則分別命名為:精氨酸豐富基質(zhì)蛋白(Argnine-rich matrix protein，Pm-RRMP)、甘氨酸豐富基質(zhì)蛋白（Glycine-rich ma

3、trix，Pm-GRMP）、脯氨酸豐富基質(zhì)蛋白(Proline-rich matrixprotein，Pm-PRMP)、絲氨酸豐富基質(zhì)蛋白（Serine-rich matrix protein，Pm-SRMP），cDNA全長分別為1063bp、2088bp、2312bp、3154bp，分別編碼273、565、589和958個氨基酸，均為具有信號肽執(zhí)行胞外功能的分泌蛋白。同樣，利用Real-time PCR技術進行基因組織差異表達分析發(fā)現(xiàn)

4、除了Pm-RRMP，另外3個基因的mRNA都主要在外套膜中央?yún)^(qū)及珍珠囊中呈現(xiàn)高表達，可能參與珍珠層的礦化過程，而Pm-RRMP在邊緣膜中呈現(xiàn)高表達可能與貝殼棱柱層形成相關。RNA干擾后目的基因在外套膜中央?yún)^(qū)的表達量顯著下降，結合SEM觀察貝殼內(nèi)表面的超微結構發(fā)現(xiàn)，珍珠層結構排列不規(guī)則，片層之間界限模糊，有融合的趨勢，說明這4個基因在貝殼形成過程中起著重要作用。另外原位雜交研究還發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝Pm-PRMP基因的mRNA表達定位于外套膜的

5、外表皮，進一步證明它與珍珠層形成相關。
　　2.兩個有絲氨酸蛋白酶抑制劑功能注釋的基因分別命名為Pm-NSPI-1、Pm-NSPI-2，cDNA全長分別為766 bp和702 bp，分別編碼164和183個氨基酸，預測分析均具有信號肽，說明兩者均為分泌蛋白。成熟肽中都存在2個串聯(lián)的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因家族結構域，根據(jù)這些特有的序列特征，我們初步確定本實驗所克隆的2條序列均為馬氏珠母貝Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑

6、家族成員。利用Real-time PCR技術進行基因的組織差異表達分析發(fā)現(xiàn)，這2個基因都主要在外套膜中央?yún)^(qū)及珍珠囊組織中高表達;RNA干擾后發(fā)現(xiàn)目的基因在中央膜的表達量顯著下降，SEM觀察發(fā)現(xiàn)干擾后珍珠層結晶體表面粗糙，排列錯亂，六邊形結構不明顯;運用原位雜交技術進行組織定位，研究發(fā)現(xiàn)Pm-NSPI-2基因的mRNA特異性地表達于外套膜的外表皮，這些研究結果均可表明篩選出的有絲氨酸蛋白酶抑制劑功能注釋的目的基因均在珍珠層的形成中發(fā)揮重要

7、作用。通過構建Pm-NSPI-1和Pm-NSPI-2的原核表達重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中進行優(yōu)化表達，發(fā)現(xiàn)Pm-NSPI-1重組蛋白在IPTG濃度為0.1mM，誘導時間為12h，誘導溫度為37℃時為其蛋白誘導的最佳條件;而相應地Pm-NSPI-2在IPTG濃度為0.8mM，誘導時間為8h，誘導溫度為37℃時為其蛋白誘導的最佳條件，兩者均以包涵體的形式存在。利用Westem blotting技術檢測發(fā)現(xiàn):優(yōu)化誘導表達的重組蛋白能夠與帶有His