RAGE在間歇缺氧致動脈粥樣硬化作用中的體外研究.pdf

1、背景和目的：
　　阻塞性呼吸睡眠暫停低通氣綜合征（OSAHS）的主要臨床特征是睡眠狀態(tài)下的間歇缺氧(IH)，也是導致包括動脈粥樣硬化在內(nèi)的很多心血管疾病的獨立危險因素。在臨床觀察中發(fā)現(xiàn) OSAHS病人外周血單核細胞 RAGE含量明顯高于正常人，持續(xù)正壓通氣治療能減少病人外周血單核細胞RAGE表達。OSAHS致動脈粥樣硬化的具體發(fā)病機制尚不明確。目前研究表明RAGE/AGEs配體系統(tǒng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。為了探

2、討 RAGE/AGEs在OSAHS致動脈粥樣硬化中的作用，本實驗擬使用THP-1（人單核細胞白血病細胞）模擬IH導致動脈粥樣硬化的體外細胞模型，使用RNA干擾法沉默THP-1細胞的RAGE基因表達，檢測其對IH條件下的THP-1細胞單核細胞趨化、巨噬細胞轉化、泡沫細胞細胞形成等的影響。
　　方法：
　　1.首先檢測THP-1細胞在IH0h、12h、24h、48h后RAGE、NF-kB p65、AGEs表達量。
　　2.

3、然后使用靶向RAGE的shRNA構建的慢病毒轉染THP-1細胞，并篩選出沉默RAGE效率最高的穩(wěn)定細胞株用于后續(xù)實驗。實驗分為四組：空白對照組：正常培養(yǎng)；實驗對照組A：RAGE（-/-）+正常培養(yǎng)；實驗對照組B：IH培養(yǎng)。D：實驗組：RAGE（-/-）+IH培養(yǎng)。
　　3.THP-1細胞及沉默RAGE的THP-1細胞按上述分組處理，24小時后比較四實驗組間單核細胞聚集指標MCP-1、CCR2，巨噬細胞轉化指標CD14、CD68表達

4、量差異。
　　4. THP-1細胞及沉默RAGE的THP-1細胞經(jīng)PMA（100ng/ml）誘導分化為巨噬細胞，誘導分化所得 THP-1細胞源性巨噬細胞按上述實驗分組，并在培養(yǎng)基中加入終濃度為50ug/ml ox-LDL誘導巨噬細胞泡沫細胞化，24小時后油紅O染色評估四組間泡沫細胞形成差異。
　　結果：
　　1.IH處理后，THP-1細胞RAGE、NF-kB p65表達經(jīng)WB驗證在一定范圍內(nèi)隨時間呈遞增趨勢，RAGE在

5、 IH后24小時表達量達高峰（RAGE/GAPDH1.043±0.10），并可持續(xù)至IH48小時（RAGE/GAPDH1.289±0.18，P＜0.05）， NF-kB p65在IH12小時后表達量達高峰（NF-kB p65/GAPDH0.30±0.04，P＜0.05），可持續(xù)至IH24小時（NF-kB p65/GAPDH0.32±0.03，P＜0.05），并于IH后48小時（NF-kB p65/GAPDH0.21±0.03，P＜0.0

6、5）開始降低。上清液中AGEs48小時內(nèi)表達量隨IH時間的增加而增加（P＜0.05）。
　　2.單核細胞趨化指標MCP-1、CCR2，與空白對照組相比，IH培養(yǎng)組THP-1細胞MCP-1、CCR2表達量增加（P＜0.05）；與IH培養(yǎng)比較，RAGE（-/-）+IH培養(yǎng)組THP-1細胞MCP-1、CCR2表達量減少（P＜0.05）。
　　3.巨噬細胞分化指標CD14、CD68，與空白對照組相比，IH培養(yǎng)組THP-1細胞 CD1

7、4、CD68表達量增加（P＜0.05）；與 IH培養(yǎng)比較，RAGE（-/-）+IH培養(yǎng)組THP-1細胞CD14、CD68表達量減少（P＜0.05）。
　　4、IH可以促進巨噬細胞泡沫細胞生成，沉默RAGE基因可以抑制IH導致的巨噬細胞泡沫化。
　　結論：
　　1. THP-1細胞RAGE、NF-kB p65、AGEs的表達量在一定時間范圍內(nèi)隨IH時間的增加而增加。
　　2. RAGE可以促進IH導致的THP-1細