Nrf2-ARE信號通路對腸缺血再灌注損傷的保護作用研究.pdf

1、腸缺血再灌注(intestihal ischemia reperfusion,IIR)損傷是臨床外科常見的危急重癥之一,常發(fā)生于急性腸系膜缺血、嚴重燒傷、失血、創(chuàng)傷和感染性休克,以及腹主動脈瘤和小腸移植等復雜的外科手術治療過程中。腸缺血再灌注損傷是系統(tǒng)性炎癥反應綜合征(systemicinflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multivle organ dysfunction sy

2、ndrome,MODS)的始動因素,具有極高的發(fā)病率和死亡率。繼發(fā)于小腸移植術后的腸缺血再灌注損傷還會進一步加重免疫排斥反應,并最終導致小腸移植的失敗。腸缺血再灌注損傷的預防和治療是外科臨床面臨的重要問題。
　　 腸缺血再灌注損傷的危害不僅局限于腸道本身,同時它還會引起嚴重的遠隔臟器損傷,其機制復雜。其中,腸道屏障功能被破壞,菌群移位,毒性物質如炎癥介質、細菌毒素等釋放入血,活性氧自由基(reactiveoxygen speci

3、es,ROS)被激活,形成氧化應激,是損傷機制中極為關鍵的環(huán)節(jié)。我們和其他學者的研究表明,這種氧化應激和炎癥介質所引起的遠隔器官損傷的病理生理過程是通過多種分子機制和細胞因子的參與完成的,多種信號通路參與其中,包括:1.核因子KB(nuclear factor kappaB,NFKB)的活化;2.泛素.蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system,UPS)的作用;3.髓樣細胞表達的觸發(fā)受體-1(Triggerin

4、g ReceptorExvressed on Myeloid Cells1,TREM-1)信號通路的作用:4.聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase1,PARP-1)信號通路的作用等。研究發(fā)現(xiàn),在各種信號通路被ROS激活并產生炎癥放大的同時,另外一些基因蛋白也可能被活化并產生保護作用。
　　 轉錄因子NF-E2相關因子2(transcription factor NF-E2-relate

5、dfactor-2,Nrf2)是一種重要的內源性抗氧化應激的調節(jié)因子,生理狀態(tài)下定位于細胞漿,與胞質接頭蛋白(Kelch-like ECH associating protein1,Keap-1)結合形成復合物。當受到氧化應激、親電子試劑等的刺激后,迅速解離出來并活化轉位進入細胞核,與抗氧化反應元件(antioxidantresponse element,ARE)結合,進而誘導其調控的靶基因表達血紅素加氧酶1(heme oxygenas

6、e1,HO-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)和NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NAD(P)H:quinoneoxidoreductase1,NQ01)等抗氧化和解毒酶,從而對抗ROS引發(fā)的氧化應激。因此,調控Nrf2-ARE信號通路可能是預防和治療氧化應激所致疾病的重要手段和方法。
　　 隨著Nrf2-ARE信號通路能夠減輕ROS損害作用的發(fā)現(xiàn),有學者對其在臟器缺血再灌注損傷中

7、的保護作用進行了相關研究,研究顯示,Nrf2-ARE信號通路對于心、腦和腎臟缺血再灌注損傷具有重要的保護作用,但其在腸缺血再灌注損傷中的保護作用尚不清楚。
　　 萊菔硫烷(Sulforaphane,SFN)是一種異硫氰酸鹽,主要來源于綠花椰菜一類的十字花科蔬菜,具有抗氧化、抗腫瘤等生物學特性,作為化學預防藥物已引起廣大研究者的關注。該化合物是已知的Nrf2重要的激活劑,能夠誘發(fā)Nrf2活化轉位入核,與ARE結合,正向調控Ⅱ相解毒

8、酶的表達,清除ROS。近年來研究開發(fā)的中藥活性成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是從綠茶中提取的主要的活性和水溶性成分,是兒茶素中含量最高的組分,具有抗氧化作用。
　　 本研究采用大鼠腸缺血再灌注模型,應用已知藥物誘導激活Nrf2-ARE信號通路,探討Nrf2-ARE信號通路對于腸缺血再灌注腸道及遠隔臟器損傷的保護作用,再進一步驗證中藥活性成分EGCG預處理對腸缺血再灌注多

9、臟器損傷的保護作用,以期為腸缺血再灌注多臟器損傷的預防和治療提供一種新的靶點,同時也為EGCG的開發(fā)利用提供更有利的理論依據(jù)。
　　 第一部分:Nrf2-ARE信號通路在大鼠腸缺血再灌注損傷中的作用
　　 目的:通過分析Nrf2-ARE信號通路誘導藥物預處理對腸道Nrf2和HO-1的表達和對氧化應激指標的影響,研究Nrf2-ARE信號通路在大鼠腸缺血再灌注(IIR)損傷中的保護作用及機制,為IIR損傷提供一種新的預防和治

10、療靶點。
　　 方法:32只雄性SD大鼠隨機分為control組、SFN control組、IIR組和SFN+IIR組,通過夾閉腸系膜上動脈(superior mesenterie artery,SMA)60 min、再灌注120 min,建立IIR損傷模型。預處理組于缺血前30分鐘分別以5 mg/kg SFN行腹腔注射,對照組僅行剖腹術及SMA分離術。再灌注結束后,取小腸組織。觀察大鼠腸組織形態(tài)學和病理學,測定小腸組織勻漿超氧

11、化物岐化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽(GSH)、GSH-Px,采用免疫組化法觀察小腸組織Nrf2和HO-1表達并用Western-blot法進行檢測驗證。
　　 結果:1.與control相比,IIR組:(1)小腸粘膜及粘膜下出現(xiàn)水腫、出血,小腸粘膜缺損、斷裂(P＜0.01);(2)小腸組織SOD活性降低(P＜0.01),MFO活性增強(P＜0.01)；(3)小腸組織GSH水平均顯著降低(P＜0.01);(4)

12、小腸組織Nrf2、HO-1表達增強(P＜0.01.P＜0.01)。2.與cortrol相比,SFN control組:(1)小腸組織GSH-Px水平明顯增加(P＜0.01);(2)小腸組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達增多(P＜0.01,P＜0.01)。3.與IIR組相比,SFN+IIR組:(1)小腸組織的病理表現(xiàn)及損傷程度明顯減輕(P＜0.05);(2)小腸組織勻漿SOD活性升高(P＜0.05),MPO活性降低(P＜0.05);(3)

13、小腸組織GSH和GSH-Px水平明顯升高(P＜0.05,P＜0.01);(4)小腸組織Nrf2、HO-1表達增強(P＜0.01,P＜0.05)。
　　 結論:腸缺血1小時再灌注2小時可導致明顯的小腸組織損傷,表現(xiàn)為小腸擴張,腸粘膜及粘膜下水腫、出血,粘膜缺損、斷裂,氧化應激指標增加和抗氧化應激指標的降低。通過Nrf2-ARE信號通路誘導藥物預處理后,增加了小腸組織Nrf2和HO-1的表達,同時伴有小腸組織損傷的減輕,氧化應激指標

14、降低和抗氧化應激指標的升高,說明Nrf2信號通路參與了腸缺血再灌注損傷的保護過程,Nrf2-ARE信號通路在大鼠腸缺血再灌注(IIR)腸道損傷中起保護作用。
　　 第二部分:SFN在大鼠腸缺血再灌注肝、肺損傷中的保護作用
　　 目的:通過分析已知藥物SFN預處理誘導Nrf2-ARE信號通路對IIR動物模型肝、肺組織Nrf2和HO-1的表達和對氧化應激指標的影響,研究SFN通過誘導Nrf2-ARE信號通路產生對大鼠IIR引

15、發(fā)的遠隔臟器肝、肺損傷的保護作用及機制。
　　 方法:32只雄性SD大鼠隨機分為control組、SFN control組、IIR組、SFN+IIR組,通過夾閉SMA60 min、再灌注120 min,建立IIR損傷模型。預處理組于缺血前30分鐘分別以5 mg/kg SFN行腹腔注射,對照組僅行剖腹術及SMA分離術。再灌注結束后,取肝、肺組織。觀察大鼠肝、肺組織形態(tài)學和病理學,檢測肝功能:血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨

16、酸氨基轉移酶(AST):測定肺組織支氣管肺泡灌洗液蛋白(brochia alveolus lung fluid protein,BALFP);測定肝、肺組織勻漿SOD、MPO、GSH、GSH-Px,采用免疫組化法觀察肝、肺組織Nrf2和HO-1表達并用Western-blot法檢測驗證。
　　 結果:1.腸缺血再灌注誘發(fā)了肝、肺損傷,表現(xiàn)為與control相比,IIR組:(1)血清ALT、AST明顯升高(P＜0.01,P＜0.0

17、1)；(2)肺組織BALFP增高(P＜0.01)；(3)肝、肺組織出現(xiàn)明顯的水腫、出血和炎細胞浸潤;(4)肝、肺組織SOD活性降低(P＜0.01,P＜0.05),MPO活性增強(P＜0.01,P＜0.05);(5)肝、肺組織GSH水平均顯著降低(P＜0.01,P＜0.05);(6)肝、肺組織HO-1表達增強(P＜0.01,P＜0.01)；(7)肝、肺組織Nrf2表達增強(P＜0.05,P＜0.01)。2.與control相比,SFN c

18、ontrol組:(1)肝、肺組織GSH-Px水平明顯增加(P＜0.05,P＜0.01)；(2)肝、肺組織中HO-1表達增多(P＜0.05,P＜0.01)；(3)肝、肺組織中Nrf2表達增多(P＜0.05,P＜0.01)。3.與IIR組相比,SFN+IIR組:(1)肝損傷減輕,血清ALT、AST明顯減低(P＜0.01,P＜0.05);(2)肺損傷減輕,肺組織BALFP降低(P＜0.05)；(3)肝、肺組織的病理表現(xiàn)及損傷程度明顯減輕;(4

19、)肝、肺組織勻漿SOD活性升高(P＜0.01,P＜0.05),MPO活性降低(P＜0.01,P＜0.05);(5)肝、肺組織GSH水平明顯升高(P＜0.05,P＜0.01);(6)肝、肺組織GSH-Px水平明顯升高(P＜0.05,P＜0.01)；(7)肝、肺組織HO-1表達增強(P＜0.01,P＜0.01);(8)肝、肺組織Nrf2表達增強(P＜0.05,P＜0.05)。
　　 結論:IIR引發(fā)遠隔臟器肝、肺損傷,表現(xiàn)為肝、肺組

20、織水腫、出血和炎細胞浸潤,SFN預處理后,激發(fā)活化Nrf2-ARE信號通路,肝、肺組織Nrf2、HO-1表達增加,抑制了組織炎性浸潤及氧化應激,肝、肺組織病理損傷的程度減輕,說明SFN通過激發(fā)活化Nrf2-ARE信號通路對大鼠IIR引發(fā)的遠隔臟器肝、肺損傷起保護作用。
　　 第三部分:EGCG在大鼠腸缺血再灌注肝、肺損傷中的保護作用
　　 目的:研究EGCG對大鼠腸缺血再灌注肝、肺損傷的保護作用,探討其是否具有與SFN相

21、同的Nrf2-ARE信號通路激活作用,從而對腸缺血再灌注肝、肺損傷產生保護作用,為EGCG的開發(fā)利用提供更有利的理論依據(jù)。
　　 方法:32只雄性SD大鼠隨機分為對照組、EGCG control組、IIR組、EGCG+IIR組,通過夾閉腸系膜上動脈60 min、再灌注120 min,建立IIR損傷模型。預處理組于缺血前30分鐘分別以50 mg/kg EGCG行腹腔注射,對照組僅行剖腹術及SMA分離術。再灌注結束后,取肺組織。觀察

22、大鼠肝、肺組織形態(tài)學和病理學,檢測肝功能:ALT、AST:測定肺組織含水率:測定肝、肺組織勻漿SOD、MPO、GSH、GSH-Px,采用免疫組化法觀察肝、肺組織Nrf2和HO-1表達并用Western-blot法檢測驗證。
　　 結果:1.腸缺血再灌注誘發(fā)了肝、肺損傷,與對照組相比,IIR組:(1)血清ALT、AST明顯升高(P＜0.01,P＜0.05);(2)肺組織含水率增高(P＜0.01);(3)肝、肺組織出現(xiàn)明顯的水腫、出

23、血和炎細胞浸潤;(4)肝、肺組織SOD活性降低(P＜0.01,P＜0.01),MPO活性增強(P＜0.01,P＜0.01);(5)肝、肺組織GSH水平均顯著降低(P＜0.05,P＜0.05);(6)肝、肺組織HO-1表達增強(P＜0.01,P＜0.01);(7)肝、肺組織Nrf2表達增強(P＜0.05,P＜0.05)。2.與對照組相比,EGCG control組:(1)肝、肺組織GSH-Px水平明顯增加(P＜0.01,P＜0.01);(

24、2)肝、肺組織中HO-1表達增多(P＜0.01,P＜0.01);(3)肝、肺組織中Nrf2表達增多(P＜0.05,P＜0.01)。3.與IIR組相比,EGCG+IIR組:(1)肝損傷減輕,血清ALT、AST明顯減低(P＜0.01,P＜0.05);(2)肺損傷減輕,肺組織含水率降低(P＜0.01);(3)肝、肺組織的病理表現(xiàn)及損傷程度明顯減輕;(4)肝、肺組織勻漿SOD活性升高(P＜0.01,P＜0.05),MPO活性降低(P＜0.01,

25、P＜0.01);(5)肝、肺組織GSH水平明顯升高(P＜0.01,P＜0.01)；(6)肝、肺組織GSH-Px水平明顯升高(P＜0.01,P＜0.01);(7)肝、肺組織HO-1表達增強(P＜0.01,P＜0.01);(8)肝、肺組織Nrf2表達增強(P＜0.01,P＜0.05)。
　　 結論:IIR引發(fā)遠隔臟器肝、肺損傷,表現(xiàn)為肝、肺組織水腫、出血和炎細胞浸潤,通過EGCG預處理,有效降低了肝、肺損傷的程度,同時肝、肺組織Nr

26、f2、HO-1表達增加。實驗證明,天然中草藥綠茶的有效活性成分EGCG,具有與已知藥物SFN相同的作用效果,通過激發(fā)活化Nrf2-ARE信號通路,對大鼠腸缺血再灌注遠隔臟器肝、肺損傷具有保護作用。
　　 本研究利用大鼠腸缺血再灌注模型,采用生化自動分析、免疫組化和Western blot分析等分子生物學方法對原發(fā)臟器腸道,以及遠隔臟器肝、肺功能(AST、ATL、肺含水率和BALFP);腸、肝、肺組織氧化損傷水平(SOD);白細胞

27、趨化因子(MPO):Nrf2的激活表達和Ⅱ相抗氧化反應酶系統(tǒng)(GSH、GSH-Px、HO-1)進行了檢測,探討Nrf2-ARE信號通路在腸缺血再灌注損傷保護機制中的作用,以及SFN和EGCG預處理對腸缺血再灌注腸道及遠隔臟器損傷的保護作用。
　　 結果表明:腸缺血再灌注不但能夠導致原發(fā)臟器腸道的損傷,還能夠引起遠隔臟器肝、肺組織的損傷。病理學表現(xiàn)為腸、肝、肺組織的出血、滲出、中性粒細胞浸潤；組織結構破壞;肝功能受損；肺組織含水率

28、和BALFP增加;腸、肝和肺組織中的氧化損傷指標和炎癥性指標如:SOD含量下降,MPO的含量增加。采用SFN和EGCG預處理后,腸、肝和肺組織Nrf2的核表達增強,Nrf2-ARE信號通路被激活,Ⅱ相抗氧化反應酶系統(tǒng)的水平增加,腸、肝和肺組織損傷程度明顯減輕,說明Nrf2-ARE信號通路對于腸缺血再灌注腸道損傷及遠隔臟器肝、肺損傷起保護作用,同時,進一步驗證了天然中草藥綠茶的有效活性成分EGCG,可以誘導活化Nrf2-ARE信號通路,對